本发明属于生物，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株、制备方法及应用。
背景技术：
1、由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratorysyndrome virus，prrsv)感染所致的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome，prrs)，是除非洲猪瘟(african swine fever，asf)外最重要的猪病毒性传染病之一。prrsv可感染各个年龄段的猪，引起怀孕母猪流产、死产及所有年龄段的猪呼吸功能障碍，造成巨大的经济损失。
2、prrsv是巢式病毒目、动脉炎病毒科的单股正链rna病毒，具有严格的宿主嗜性和细胞嗜性。在自然感染下，prrsv的靶细胞主要是完全分化的猪肺泡巨噬细胞(pams)。体外传代培养条件下，只有非洲绿猴肾细胞ma104衍生的marc-145细胞和过表达cd163的crl2843-cd163细胞可以支持各种prrsv感染。prrsv基因组全长约15kb，至少可分为orf1a、orf1b、orf2a、orf2b、orf3、orf4、orf5、orf5a、orf6和orf7等10个开放阅读框。其中orf1a和orf1b编码与复制酶相关的非结构蛋白，约占prrsv全基因组的四分之三，可以进一步水解为nsp1～nsp12等十多个非结构蛋白，orf1b的表达依赖于保守的核糖体移码机制；orf2a-orf7编码结构蛋白，占基因组长度的四分之一。orf3基因编码的高度糖基化gp3蛋白，由一个n端信号肽、一个高度糖基化的结构域、一个疏水区和一个c端亲水部分的结构域组成。gp3蛋白与gp2蛋白、gp4蛋白形成异源三聚体，与prrsv核心受体cd163相互作用，参与prrsv脱颗粒等复制过程。prrsv基因组紧凑，orf2a-orf7间多具有移码的重叠序列，如prrsvorf2a与orf3间重叠148bp、orf3与orf4间重叠220bp、orf5与orf6间重叠16bp等。研究表明，prrsv非结构蛋白nsp2高变区的部分序列缺失后不影响完整prrsv病毒粒子的产生，但除此外，其他结构蛋白基因的缺失对完整的感染性病毒粒子的产生是致命的。目前，prrsv gp3蛋白结构和抗原特性尚未解析清楚，亦没有研究人员对prrsv的orf3基因进行缺失。
3、复制缺陷型病毒由于缺失一种或多种病毒基因组中与复制或病毒颗粒合成和组装相关的必需基因，导致这些病毒存在功能性缺陷。复制缺陷型病毒只能在表达缺失基因的互补细胞系中复制增殖，而在正常细胞中只能产生最多单轮感染但不能有效复制产生子代病毒粒子。因此复制缺陷型病毒天然具有安全性优势，且由于单轮感染的特性，其较灭活疫苗有更好的激活细胞免疫的效果，是新型疫苗研发的重要方向。
4、反向遗传技术是通过dna重组、核苷酸定点突变等技术，有目的地精确改造病毒基因结构，借助体外转染等手段，在宿主体内拯救出病毒的技术，广泛应用于病毒研究。反向遗传技术为阐明prrsv的遗传进化、致病性、蛋白功能等提供了良好的平台。利用反向遗传操作技术对prrsv基因组特定orf进行缺失，构建复制缺陷的病毒，研发新型的prrsv疫苗，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
5、针对上述技术问题，本发明借助反向遗传技术构建缺失prrsv orf3基因的复制缺陷型prrsv，不仅可以为深入探究prrsv病毒蛋白功能提供生物材料，还能成为安全高效的新型prrsv疫苗研发提供重要理论依据，有望成为突破当前prrsv疫苗局限性的新型prrs疫苗候选株。
技术实现思路
1、本发明提供一种复制缺陷型猪繁殖与呼吸综合征病毒株，该病毒株仅能在稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3蛋白的marc-145细胞系中增殖，在其他prrsv易感细胞内仅产生单轮感染，有望成为一种安全性好的新型猪繁殖与呼吸综合征疫苗株。
2、具体包括以下内容：
3、本发明的首要目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株，所述的复制缺陷型病毒株将亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因的第346-543位核苷酸缺失得到，所述的亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒的orf3基因序列如seq id no.1所示。
4、优选的，所述的亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712。
5、优选的，所述的复制缺陷型病毒株dorf3序列如seq id no.2所示。
6、本发明的第二目的是提供所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株的制备方法，包括如下步骤：利用反向遗传操作技术手段缺失猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712的orf3基因第346至543位的核苷酸序列构建缺失感染性克隆；构建稳定表达orf3基因编码的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3蛋白的marc-145细胞系，对缺失感染性克隆进行病毒拯救，获得猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型病毒株。
7、优选的，具体包括如下步骤：
8、(1)缺失感染性克隆的构建：采用反向遗传操作技术缺失猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712株orf3基因第346至543位的核苷酸片段，将其连入pbelobac-11质粒构建获得感染性克隆质粒pbac-prrsv-dorf3；
9、(2)稳定表达gp3蛋白的细胞系的构建：将猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712株的orf3基因克隆至含有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体中，转染至hek293t细胞包装出重组慢病毒，感染至marc-145细胞系，利用嘌呤霉素筛选，单克隆细胞系进行纯化，获得稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3蛋白的marc-145细胞系marc-145orf3；
10、(3)病毒拯救：将步骤(1)获得的感染性克隆质粒pbac-prrsv-dorf3转染至步骤(2)得到的稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3蛋白的marc-145orf3细胞系，于37℃，5％co2细胞培养箱培养，直到marc-145orf3细胞系产生明显的细胞病变，获得复制缺陷型猪繁殖与呼吸综合征病毒rprrsv-dorf3。
11、本发明的第三目的是提供一种细胞系，所述的细胞系稳定表达由猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因编码的gp3蛋白。
12、优选的，所述的细胞系为marc-145细胞系。
13、本发明的第四目的是提供所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型病毒株在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征产品中的应用。
14、优选的，所述的预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征产品为预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗。
15、本发明的第五目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，所述的猪繁殖与呼吸综合征疫苗包括所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株。
16、本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株，所述的复制缺陷型病毒株将亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组orf3基因的第346-543位核苷酸缺失得到。(2)本发明还提供了稳定表达由猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因编码的gp3蛋白的细胞系；(3)所述的复制缺陷型病毒株在稳定表达猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因编码的gp3蛋白的细胞系中正常连续复制，在marc-145、crl2843-cd163、pams等其他易感细胞系中仅进行单轮感染。(4)本发明所述的复制缺陷型病毒株有望成为一种安全有效的活病毒疫苗株，解决prrsv灭活疫苗免疫效果差和弱毒疫苗存在持续带毒、间歇排毒和毒力返强的潜在危害，对于prrsv防控具有重要意义。
1.一种猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株，其特征在于，所述的复制缺陷型病毒株将亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因的第346-543位核苷酸缺失得到，所述的亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒的orf3基因序列如seq id no.1所示。
2.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株，其特征在于，所述的亲本猪繁殖与呼吸综合征病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712。
3.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株，其特征在于，所述的复制缺陷型病毒株dorf3序列如seq id no.2所示。
4.如权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用反向遗传操作技术手段缺失猪繁殖与呼吸综合征病毒sd-yl1712的orf3基因第346至543位的核苷酸序列构建缺失感染性克隆；构建稳定表达orf3基因编码的猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3蛋白的marc-145细胞系，对缺失感染性克隆进行病毒拯救，获得猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型病毒株。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
6.一种细胞系，其特征在于，所述的细胞系稳定表达由猪繁殖与呼吸综合征病毒orf3基因编码的gp3蛋白。
7.根据权利要求6所述的细胞系，其特征在于，所述的细胞系为marc-145细胞系。
8.如权利要求1-3任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒复制缺陷型病毒株在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征产品中的应用。
9.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征产品为预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征疫苗。
10.一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗，其特征在于，所述的猪繁殖与呼吸综合征疫苗包括权利要求1-3任一项所述的猪繁殖与呼吸综合征复制缺陷型病毒株。
