本发明涉及生物，具体涉及一种实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法。
背景技术：
1、grna是一种非编码rna，它在细胞内只起到特定基因组编辑的作用，而不参与蛋白质的翻译过程。因此，传统的蛋白质表达分析方法如western blot或elisa并不适用于grna的定量检测。
2、实时荧光定量pcr（quantitative real-time pcr）是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（pcr）循环后产物总量的方法。它可以从复杂的样品中检测出微量的目标核酸，具有灵敏度高、特异性好、定量准确、快速简便及高通量等特点。如今，实时荧光定量pcr在动植物研究中具有广泛的应用前景，实时荧光定量 pcr 技术是定量 pcr 技术的一次飞跃，自建立以来, 发展迅速，应用 广泛, 表明其具有强大的生命力。由于其特异性好，精确性高，操作简便，检测时间短，误差小以及自动化程度高等优点，已成为分子实验室必备的检测手段，广泛用于分子生物学和植物研究等领域。
3、实时荧光定量pcr可以对mrna、mirna、lncrna、circrna进行表达量的检测，但现有技术对grna表达量的检测不够成熟，误差较大，结果不准确，为解决这一问题，现在常规的手段是在pcr前添加逆转录的步骤，并命名为rt-pcr（逆转录聚合酶链反应），它可以将rna转录成相应的cdna，并利用pcr扩增grna的序列，再通过比较pcr扩增产物的强度或定量pcr的方法，可以初步评估grna的表达量，但是还存在着以下几点缺陷：
4、由于grna的序列通常与基因组中的多个区域具有高度的同源性，因此选择特异引物用于grna的逆转录和扩增较为困难，这会导致引物在非目标序列上的结合和扩增，引起假阳性结果。grna是一种相对较短的rna分子，其结构和序列特点与mrna不同。由于grna通常具有某种特定的结构，如二级结构、片段互补等，逆转录过程中可能遇到技术上的挑战，特别是在使用常规的逆转录酶和引物时，可能会出现逆转录效率低下或者不稳定的情况。与检测其他rna分子不同，grna的表达水平通常难以定量。由于grna在细胞内往往以非常低的丰度存在，并且缺乏特定的参考基因用于标准化，因此对grna的定量结果可能具有较大的误差。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供一种实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，能够快速实时的对grna的表达量进行检测，具有特异性高、敏感度高以及准确的定量结果等优势。
2、本发明提供一种实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法,包括对总rna中目标基因grna和内参基因的逆转录，其特征在于，在目标基因grna的逆转录反应体系中额外添加特异性逆转录引物。
3、本发明针对目标基因grna序列的特异性，在逆转录反应体系的引物上添加有一段特异性识别的序列，这个特异性逆转录引物具有与grna互补的序列，其中一部分与目标grna序列互补，形成一个稳定的链接位点，另一部分为互补的部分在接下来的循环中可以重复出现；后续逆转录反应会结合这个特异性逆转录引物和grna，通过逆转录酶的作用将其转录为cdna，逆转录后，使用pcr方法扩增目标grna的cdna。特异性逆转录引物的序列会保证只有目标grna的cdna被扩增，具有较高的特异性，减少其他具有同源性的逆转录与扩增，从而防止假阳性结果的出现。
4、进一步的，所述特异性逆转录引物的核苷酸序列为grna scaffold序列以及grna的部分反向互补序列。
5、进一步的，所述grna scaffold序列如seq id no.1所示。
6、进一步的，包含以下步骤：
7、s1、提取样品总rna；
8、s2、总rna的逆转录，对目标基因grna逆转录引物的设计以及对内参基因逆转录引物的设计，将目标基因grna和内参基因分别进行逆转录，得到两份cdna；
9、s3、目标基因及内参基因的扩增及实时荧光定量检测，使用sybr染料法分别对目标基因grna靶点位置和内参基因进行特异性扩增，然后通过荧光信号采集进行qpcr检测。
10、进一步的，所述grna的部分反向互补序列位于grna的 3’端，碱基数量为6个。
11、进一步的，所述内参基因为snrna u6内参基因，所述内参基因的逆转录引物为3’端选18-25nt序列长度的反向互补序列。
12、进一步的，所述s3中目标基因的qpcr上游引物的核苷酸序列为5’端连接靶点核苷酸序列以及grna骨架核苷酸序列，如seq id no.2所示，tm值为60°c，引物长度为18~25bp。
13、进一步的，所述s3中目标基因的qpcr下游引物的核苷酸序列为grna scaffold的部分序列，如seq id no.3所示。
14、进一步的，所述s3中内参基因的qpcr上游引物为5’端选取17-28nt序列，所述内参基因的qpcr下游引物为5’端选取17-28nt序列长度的反向互补序列。
15、进一步的，所述内参基因的下游引物核苷酸序列中gc含量为40%~60%，tm值为56-60℃。
16、综上所述，本申请与现有技术相比至少具有以下一种有益技术效果：
17、本发明可以直接利用实时荧光定量pcr的方法来检测grna表达量，其特异性好，精确性高，操作简便，检测时间短，误差小以及自动化程度高。并且为grna表达量的检测提供新思路。
1.一种实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法,包括对总rna中目标基因grna和内参基因的逆转录，其特征在于，在目标基因grna的逆转录反应体系中额外添加特异性逆转录引物，所述特异性逆转录引物的核苷酸序列为grna scaffold序列以及grna的部分反向互补序列。
2.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述grna scaffold序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于，包含以下步骤：
4.如权利要求3所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述grna的部分反向互补序列位于grna的 3’端，碱基数量为6个，所述部分反向互补序列的核苷酸序列如seq id no.2。
5.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述内参基因为snrna u6内参基因，所述内参基因的逆转录引物为3’端选18-25nt序列长度的反向互补序列。
6.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述s3中目标基因的qpcr上游引物的核苷酸序列为5’端连接靶点核苷酸序列以及grna骨架核苷酸序列，如seq id no.3所示，tm值为60°c，引物长度为18~25bp。
7.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述s3中目标基因的qpcr下游引物的核苷酸序列为grna scaffold的部分序列，如seq idno.4所示。
8.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于：所述s3中内参基因的qpcr上游引物为5’端选取17-28nt序列，所述内参基因的qpcr下游引物为5’端选取17-28nt序列长度的反向互补序列。
9.如权利要求1所述的实时荧光定量pcr快速检测grna表达量的方法，其特征在于，所述内参基因的下游引物核苷酸序列中gc含量为40%~60%，tm值为56-60℃。
