本发明属于生物工程，具体地说，是关于一种提高nst酶可溶性和活性的方法。
背景技术：
1、hs(硫酸乙酰肝素)是一种具有重要生理功能的磺酸化聚糖，其功能包括参与调节血液凝固、胚胎发育和炎症反应，并协助病毒/细菌感染等。目前正在广泛使用的抗凝药物肝素就是hs高度磺酸化的一种特殊形式。化学合成法是获得结构明确的肝素/hs寡糖的有力工具。最成功的例子是抗凝血酶结合戊糖磺达肝癸钠(arixtra)的全合成，其用于治疗静脉血栓栓塞性疾病。然而，比八糖更大的寡糖的化学合成极其困难，所以基于酶法的hs生物合成可作为一种有前景的替代方法。
2、在hs的生物合成途径中，首先生成由-glca/idoa-glcnac-(-葡萄糖醛酸/艾杜糖醛酸-葡萄糖胺-)组成的重复二糖单元，然后再通过ndst(n-脱乙酰酶/n-磺基转移酶)、2-o-磺基转移酶、6-o-磺基转移酶和3-o-磺基转移酶进行硫酸化修饰。其中ndst是一种双功能酶，可将glcnac转化为glcns(n-磺基葡萄糖胺)，ndase(n-脱乙酰酶)从glcnac上除去乙酰基，形成glcnh2，而nst(n-磺基转移酶)将磺基转移到glcnh2上，形成glcns。glcns的存在是hs主链上-oh磺酸化的前提，并且磺酸化模式决定了hs与靶蛋白之间相互作用的特异性。ndst基因敲除实验揭示了其对小鼠发育和细胞增殖的重要性，因此ndst酶类成为多功能hs和肝素生物合成途径的关键组成部分。
3、人类基因组中总共存在四种ndst异构体，其中，ndst-1表达最广泛，具有深远的生理意义。鉴于天然ndst脱乙酰活性差而限制下游产物累积的弊端，刘健课题组选择单独表达nst，并以udp-glcntfa(udp-三氟乙酰葡萄糖胺)代替主链上的glcnac作为磺酸化的受体，因三氟乙酰基较乙酰基更易脱去，再用nst催化paps(3′-磷酸腺苷-5′-磷酰硫酸)生成glcns，从而极大地提高了磺酸化反应效率。但nst属于高尔基体膜蛋白家族成员，存在可溶性低、表达量低、不稳定的缺点，实际应用上仍存在诸多不便，刘健等使用gst(谷胱甘肽巯基转移酶)促融标签与nst融合表达，但效果并不明显。
4、晶体结构研究表明nst结构域中存在一个pap(3′-磷酸腺苷-5′-磷酸)结合区，该区域的一些氨基酸残基可能决定了磺酸基团的供给效率，如保守残基lys-614能够与5′-磷酸酯的氧形成氢键；glu-642位于glcn部分的nh3+基团的氢键距离内，对这些关键残基进行定点突变会显著改变nst的磺酸化能力。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中所存在的上述缺点，本发明致力于提高nst酶可溶性和活性，以克服glcnh2磺酸化效率低以及nst可溶性差的问题。
2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、一种提高nst酶可溶性和活性的方法，所述nst酶通过大肠杆菌异源表达，所述方法是通过将人源的ndst-1(genebank:u17970.1)中的nst结构域(leu556-arg882)与麦芽糖结合蛋白(mbp)融合表达，同时与伴侣蛋白groel和groes共表达来实现；
4、其中，编码所述nst酶的核苷酸序列根据大肠杆菌的偏好进行密码子优化，所述优化的核苷酸序列如seq id no.1所示，其对应的氨基酸序列如seq id no.2所示。
5、根据本发明的优选实施例，所述方法还包括对nst酶的氨基酸序列进行四位点突变，所述四位点突变是将nst酶的氨基酸序列中的四个氨基酸lys-614、thr-615、ser-712、gln-715分别突变为phe、leu、tyr、asp。
6、进一步的，所述四位点突变后的nst酶的氨基酸序列如seq id no.4所示，其对应的核苷酸序列如seq id no.3所示。
7、本发明的第二个方面，提供了一种nst酶的构建方法，所述nst酶通过大肠杆菌异源表达，所述构建方法包括以下步骤：
8、s1：根据人源的ndst-1(genebank:u17970.1)中的nst结构域(leu556-arg882)的氨基酸序列，对其核苷酸序列根据大肠杆菌的偏好进行密码子优化，优化的核苷酸序列如seqid no.1所示；
9、s2：以seq id no.1所示的核苷酸序列构建表达载体，与表达伴侣蛋白groel和groes的载体共转化至大肠杆菌中，得到重组大肠杆菌；
10、s3：对得到的重组大肠杆菌进行发酵，得到相应nst酶。
11、根据本发明的优选实施例，步骤s2中构建表达载体所使用的质粒为pmal-c5x。
12、根据本发明的优选实施例，步骤s2中所使用的核苷酸序列经过了突变，突变的序列如seq id no.3所示。
13、根据本发明的优选实施例，步骤s2中所述表达伴侣蛋白groel和groes的载体为质粒pgro7。
14、本发明的第三个方面，提供一种可溶性和活性提高的nst酶，通过上述的方法构建得到。
15、本发明的第四个方面，提供了上述的nst酶用于催化n-脱乙酰肝素的磺酸化的应用。
16、根据本发明的优选实施例，所述用于催化n-脱乙酰肝素的磺酸化的条件如下：
17、ph 7.0～8.0，温度37℃，反应时间30分钟～60分钟；
18、n-脱乙酰肝素：paps：nst酶的用量比例为10μg：50μm：10ng。
19、本发明通过麦芽糖结合蛋白(mbp)和分子伴侣提高了nst蛋白的可溶性和表达量，可溶性蛋白产量可达到150mg/l，同时，对其进行关键残基的替换获得了高磺酸化活性的突变体，nst突变体对底物的亲和力显著提高，其km为71.82mm，这降低了构建磺酸化肝素中间体的难度，有较好的工业应用价值。
1.一种提高nst酶可溶性和活性的方法，所述nst酶通过大肠杆菌异源表达，其特征在于，所述方法是通过将人源的ndst-1(genebank:u17970.1)中的nst结构域(leu556-arg882)与麦芽糖结合蛋白融合表达，同时与伴侣蛋白groel和groes共表达来实现；
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对nst酶的氨基酸序列进行四位点突变，所述四位点突变是将nst酶的氨基酸序列中的四个氨基酸lys-614、thr-615、ser-712、gln-715分别突变为phe、leu、tyr、asp。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述四位点突变后的nst酶的氨基酸序列如seq id no.4所示，其对应的核苷酸序列如seq id no.3所示。
4.一种nst酶的构建方法，所述nst酶通过大肠杆菌异源表达，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中构建表达载体所使用的质粒为pmal-c5x。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中所使用的核苷酸序列经过了突变，突变的序列如seq id no.3所示。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤s2中所述表达伴侣蛋白groel和groes的载体为质粒pgro7。
8.一种可溶性和活性提高的nst酶，其特征在于，通过权利要求4～7中任一项所述的方法构建得到。
9.根据权利要求8所述的nst酶的应用，其特征在于，用于催化n-脱乙酰肝素的磺酸化。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述用于催化n-脱乙酰肝素的磺酸化的条件如下：
