本发明涉及生物，具体涉及一种膀胱癌微肿瘤模型体外药敏检测方法。
背景技术：
1、膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤。根据2009年cancer statistics肿瘤流行病学统计结果，膀胱癌分别占男性恶性肿瘤发病率的第四位和男性恶性肿瘤死亡率的第七位。
2、75-85%的膀胱癌为非肌层浸润型膀胱癌，临床上的常规治疗手段为电切术后膀胱内药物灌注治疗。尽管非肌层浸润型膀胱癌五年生存期可以达到70-80%，但其术后两年复发率高达30-40%且容易反复复发，严重影响患者术后的生存质量。
3、非肌层浸润型膀胱癌的术后灌注治疗药物选择，是影响患者术后复发率的重要因素。目前世界各国针对非肌层浸润型膀胱癌的术后灌注治疗的药物选择尚存在不同的观点。nccn指南推荐的首选方案为卡介苗，吉西他滨等药物，而《中国泌尿外科和男科疾病诊断治疗指南》则推荐蒽环类药物，羟喜树碱，吉西他滨，丝裂霉素等多种药物。目前尚无药物选择的具体指征，也无预测药物疗效的方法。非肌层浸润型膀胱癌的术后灌注治疗药物选择仍然是困扰临床治疗的难点问题。因此针对非肌层浸润型膀胱癌开发个体化的术后灌注药物选择方案是膀胱癌研究领域乃至膀胱癌诊断治疗领域的重要课题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种膀胱癌微肿瘤模型体外药敏检测方法。
2、第一方面，本发明要求保护膀胱癌微肿瘤模型在制备用于筛选膀胱癌术后灌注治疗药物的产品中的应用。
3、所述膀胱癌微肿瘤模型是采用特定培养基对从离体的膀胱癌实体瘤组织中解离出的细胞进行悬浮培养得到的；
4、所述特定培养基由抗菌抗真菌剂三抗、hepes、glutamax、人重组蛋白egf、人重组蛋白bfgf、人重组蛋白hgf、人重组蛋白msp、人重组蛋白il-2、人重组蛋白il-15、n-乙酰-l-半胱氨酸、n-2添加剂、y-27632、二氢睾酮、前列腺素e2、its-x和基础培养基组成；
5、所述抗菌抗真菌剂三抗为青霉素、链霉素和两性霉素b；
6、在所述特定培养基中，所述hepes的终浓度可为8-12mm（如10mm）；所述glutamax的终浓度可为0.8-1.2%（如1%）体积百分含量；所述人重组蛋白egf的终浓度可为10-100ng/ml（如50ng/ml）；所述人重组蛋白bfgf的终浓度可为10-50ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白hgf的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白msp的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-2的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-15的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述n-乙酰基-l-半胱氨酸的终浓度可为0.5-2mm（如1mm）；所述n-2添加剂的终浓度可为1%体积百分含量；所述y-27632的终浓度可为5-20μm（如10μm）；所述二氢睾酮的终浓度可为1-10nm（如5nm）；所述前列腺素e2的终浓度可为1-10μm（如10μm）；所述its-x的终浓度可为1%体积百分含量。
7、所述膀胱癌微肿瘤模型在筛选膀胱癌术后灌注治疗药物中的应用也属于本发明的保护范围。
8、第二方面，本发明要求保护膀胱癌微肿瘤模型在制备用于膀胱癌预后评估的产品中的应用。
9、所述膀胱癌微肿瘤模型是采用特定培养基对从离体的膀胱癌实体瘤组织中解离出的细胞进行悬浮培养得到的；
10、所述特定培养基由抗菌抗真菌剂三抗、hepes、glutamax、人重组蛋白egf、人重组蛋白bfgf、人重组蛋白hgf、人重组蛋白msp、人重组蛋白il-2、人重组蛋白il-15、n-乙酰-l-半胱氨酸、n-2添加剂、y-27632、二氢睾酮、前列腺素e2、its-x和基础培养基组成；
11、所述抗菌抗真菌剂三抗为青霉素、链霉素和两性霉素b；
12、在所述特定培养基中，所述hepes的终浓度可为8-12mm（如10mm）；所述glutamax的终浓度可为0.8-1.2%（如1%）体积百分含量；所述人重组蛋白egf的终浓度可为10-100ng/ml（如50ng/ml）；所述人重组蛋白bfgf的终浓度可为10-50ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白hgf的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白msp的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-2的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-15的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述n-乙酰基-l-半胱氨酸的终浓度可为0.5-2mm（如1mm）；所述n-2添加剂的终浓度可为1%体积百分含量；所述y-27632的终浓度可为5-20μm（如10μm）；所述二氢睾酮的终浓度可为1-10nm（如5nm）；所述前列腺素e2的终浓度可为1-10μm（如10μm）；所述its-x的终浓度可为1%体积百分含量。
13、所述膀胱癌微肿瘤模型在膀胱癌预后评估中的应用也属于本发明的保护范围。
14、针对前文第一方面和第二方面，在本发明的一个实施案例中，所述基础培养基为advanced dmem/f12培养基。
15、进一步地，在所述特定培养基中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度可为100-200u/ml（如100u/ml）；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度可为100-200µg/ml（如100µg/ml）；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素b的终浓度可为200-250ng/ml（如250ng/ml）。
16、进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗（青霉素-链霉素-两性霉素b）组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b。所述抗菌抗真菌剂三抗为“antibiotic-antimycotic,100x”（如gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品）。所述“antibiotic-antimycotic,100x”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b，利用0.85％盐液形式的青霉素g(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素b作为抗真菌剂。所述glutamax为“glutamaxtm supplement”（如gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品）。所述“glutamaxtmsupplement”的成分为l-alanyl-l-glutamine，是l-glutamine的替代物，浓度为200nm，溶剂为0.85％nacl溶液。所述n-2 supplement为“n-2supplement(100×)”（如gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品）。所述“n-2supplement(100×)”中含有终浓度为1mm的人全铁转铁蛋白（human transferrin(holo)）、500mg/l的重组胰岛素全链（insulin recombinant full chain）、0.63mg/l的孕酮（progesterone）、10mm的腐胺（putrescine）、0.52mg/l的亚硒酸盐（selenite）。所述glutamax是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的l-谷氨酰胺。所述y-27632为“y-27632 dihydrochloride（一种atp竞争性的rock-i和rock-ii抑制剂，ki分别为220nm和300nm）”（如mce#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品）。所述its-x的溶剂为ebss溶液（earle's平衡盐溶液），溶质及浓度如下：胰岛素1g/l；转铁蛋白0.55g/l；亚硒酸钠0.00067g/l；乙醇胺0.2g/l。所述dihydrotestosterone是一种内源性的雄激素性类固醇和激素，是雄激素受体的激动剂，其亲和力比睾酮高2-3倍，诱导雄激素受体信号的效力比睾酮高3倍。所述prostaglandin e2在分娩中发挥重要作用（可软化宫颈，引起子宫收缩），也刺激成骨细胞释放能刺激破骨细胞吸收的因子。
17、在前文第一方面所述应用中，进行所述筛选膀胱癌术后灌注治疗药物的方法可包括如下步骤：测定待测药物对源自受试膀胱癌患者的所述膀胱癌微肿瘤模型的体外杀伤效率；若所述体外杀伤效率高于50%，则认为所述受试膀胱癌患者对所述待测药物敏感，推荐将所述待测药物作为所述受试膀胱癌患者的术后灌注治疗药物；反之，则认为所述受试膀胱癌患者对所述待测药物耐药，不推荐将所述待测药物作为所述受试膀胱癌患者的术后灌注治疗药物。
18、在前文第二方面所述应用中，进行所述膀胱癌预后评估的方法可包括如下步骤：测定待测药物对源自受试膀胱癌患者的所述膀胱癌微肿瘤模型的体外杀伤效率；若所述体外杀伤效率高于50%，则认为所述受试膀胱癌患者对所述待测药物敏感，预测所述受试膀胱癌患者在术后灌注所述待测药物后疾病不复发；反之，则认为所述受试膀胱癌患者对所述待测药物耐药，预测所述受试膀胱癌患者在术后灌注所述待测药物后疾病复发。
19、针对 前文第一方面和第二方面所述应用，在本发明中，测定待测药物对源自所述受试膀胱癌患者的所述膀胱癌微肿瘤模型的体外杀伤效率具体可按照包括如下步骤的方法进行：
20、实验组：用所述特定培养基进行所述待测药物配制，得到所需浓度的待测药物溶液；按照1ml：1ml：3000个细胞团的比例用所述待测药物溶液和所述特定培养基重悬源自所述受试膀胱癌患者的所述膀胱癌微肿瘤模型，得到实验组重悬体系；
21、对照组：与所述实验组相比，差别仅在于用等体积的所述特定培养基替代所述待测药物溶液，得到对照组重悬体系；
22、将所述实验组重悬体系和所述对照组重悬体系分别在37℃ 5%二氧化碳条件下孵育1h，然后去除上清将用所述特定培养基重悬沉淀后在37℃ 5%二氧化碳条件下孵育7h，分别检测实验组和对照组的细胞活性，计算得到相对于对照组所述待测药物对所述膀胱癌微肿瘤模型的杀伤效率。
23、针对前文第一方面和前文第二方面，在本发明的一个实施案例中，所述待测药物为吉西他滨、表柔比星、吡柔比星或羟喜树碱。
24、相应地，当所述待测药物为吉西他滨时，其对所述膀胱癌微肿瘤模型的作用浓度可为20mg/ml；当所述待测药物为表柔比星、吡柔比星或羟喜树碱时，其对所述膀胱癌微肿瘤模型的作用浓度可为1mg/ml。
25、针对前文第一方面和前文第二方面，在本发明的一个实施案例中，所述膀胱癌为非肌层浸润型膀胱癌。
26、第三方面，本发明要求保护一种膀胱癌微肿瘤模型。
27、本发明所要求保护的膀胱癌微肿瘤模型是采用特定培养基对从离体的膀胱癌实体瘤组织中解离出的细胞进行悬浮培养得到的。
28、所述特定培养基由抗菌抗真菌剂三抗、hepes、glutamax、人重组蛋白egf、人重组蛋白bfgf、人重组蛋白hgf、人重组蛋白msp、人重组蛋白il-2、人重组蛋白il-15、n-乙酰-l-半胱氨酸、n-2添加剂、y-27632、二氢睾酮、前列腺素e2、its-x和基础培养基组成；
29、所述抗菌抗真菌剂三抗为青霉素、链霉素和两性霉素b；
30、在所述特定培养基中，所述hepes的终浓度可为8-12mm（如10mm）；所述glutamax的终浓度可为0.8-1.2%（如1%）体积百分含量；所述人重组蛋白egf的终浓度可为10-100ng/ml（如50ng/ml）；所述人重组蛋白bfgf的终浓度可为10-50ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白hgf的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白msp的终浓度可为5-25ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-2的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述人重组蛋白il-15的终浓度可为10-100ng/ml（如20ng/ml）；所述n-乙酰基-l-半胱氨酸的终浓度可为0.5-2mm（如1mm）；所述n-2添加剂的终浓度可为1%体积百分含量；所述y-27632的终浓度可为5-20μm（如10μm）；所述二氢睾酮的终浓度可为1-10nm（如5nm）；所述前列腺素e2的终浓度可为1-10μm（如10μm）；所述its-x的终浓度可为1%体积百分含量。
31、在本发明的一个实施案例中，所述基础培养基为advanced dmem/f12培养基。
32、进一步地，在所述特定培养基中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度可为100-200u/ml（如100u/ml）；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度可为100-200µg/ml（如100µg/ml）；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素b的终浓度可为200-250ng/ml（如250ng/ml）。
33、进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗（青霉素-链霉素-两性霉素b）组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b。所述抗菌抗真菌剂三抗为“antibiotic-antimycotic,100x”（如gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品）。所述“antibiotic-antimycotic,100x”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素b，利用0.85％盐液形式的青霉素g(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素b作为抗真菌剂。所述glutamax为“glutamaxtm supplement”（如gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品）。所述“glutamaxtmsupplement”的成分为l-alanyl-l-glutamine，是l-glutamine的替代物，浓度为200nm，溶剂为0.85％nacl溶液。所述n-2 supplement为“n-2supplement(100×)”（如gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品）。所述“n-2supplement(100×)”中含有终浓度为1mm的人全铁转铁蛋白（human transferrin(holo)）、500mg/l的重组胰岛素全链（insulin recombinant full chain）、0.63mg/l的孕酮（progesterone）、10mm的腐胺（putrescine）、0.52mg/l的亚硒酸盐（selenite）。所述glutamax是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的l-谷氨酰胺。所述y-27632为“y-27632 dihydrochloride（一种atp竞争性的rock-i和rock-ii抑制剂，ki分别为220nm和300nm）”（如mce#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品）。所述its-x的溶剂为ebss溶液（earle's平衡盐溶液），溶质及浓度如下：胰岛素1g/l；转铁蛋白0.55g/l；亚硒酸钠0.00067g/l；乙醇胺0.2g/l。所述dihydrotestosterone是一种内源性的雄激素性类固醇和激素，是雄激素受体的激动剂，其亲和力比睾酮高2-3倍，诱导雄激素受体信号的效力比睾酮高3倍。所述prostaglandin e2在分娩中发挥重要作用（可软化宫颈，引起子宫收缩），也刺激成骨细胞释放能刺激破骨细胞吸收的因子。
34、所述膀胱癌微肿瘤模型为panck+vim+cd3+。其中，vim表示vimentin。
35、本发明所提供的膀胱癌微肿瘤模型体外药敏检测方法，其技术的核心是：（1）建立膀胱癌微肿瘤模型，作为个体化药物筛选工具；（2）模拟膀胱癌灌注化疗的治疗过程，建立体外药物敏感性筛选实验，对多种药物进行有效性筛选；（3）经过临床随访和比对，证实该方法可以在患者治疗开始之前预测多种药物的有效性。总之，本发明方法利用患者手术标本建立为肿瘤模型进行体外药物敏感性检测，在灌注化疗开始之前预测多种药物的疗效，为药物选择提供实验依据。
1.膀胱癌微肿瘤模型在制备用于筛选膀胱癌术后灌注治疗药物的产品中的应用；
2.膀胱癌微肿瘤模型在制备用于膀胱癌预后评估的产品中的应用；
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述基础培养基为advanced dmem/f12培养基。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：在所述特定培养基中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200u/ml；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200µg/ml；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素b的终浓度为200-250ng/ml。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述待测药物为吉西他滨、表柔比星、吡柔比星或羟喜树碱。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述膀胱癌为非肌层浸润型膀胱癌。
7.一种膀胱癌微肿瘤模型，是采用特定培养基对从离体的膀胱癌实体瘤组织中解离出的细胞进行悬浮培养得到的；
8. 根据权利要求7所述的膀胱癌微肿瘤模型，其特征在于：所述基础培养基为advanced dmem/f12培养基。
9.根据权利要求7所述的膀胱癌微肿瘤模型，其特征在于：在所述特定培养基中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200u/ml；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200µg/ml；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素b的终浓度为200-250ng/ml。
