本技术涉及疫苗制备，特别涉及一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品。
背景技术：
1、流行性脑脊髓膜炎（流脑）是由脑膜炎奈瑟菌或称脑膜炎球菌引起的急性化脓性中枢神经系统感染疾病，具有发病急、进展快、传染性强、隐性感染率高、病死率高等特点，通常由脑膜炎奈瑟菌血清型a、b、c、x、y或w135群引起。流脑的预防包括分离、化学预防和接种疫苗。而针对血清型脑膜炎奈瑟菌的疫苗对流脑的预防非常有效，副作用也最小。目前国内上市的脑膜炎球菌疫苗包括脑膜炎球菌多糖疫苗（meningococcal polysaccharidevaccine，mpsv）、脑膜炎球菌多糖结合疫苗（meningococcal polysaccharide conjugatevaccine，mpcv）和含mpcv的联合疫苗。脑膜炎球菌多糖结合疫苗是通过化学键的方式将荚膜多糖与各种载体蛋白结合，形成稳定的化学结构，使原本的t细胞非依赖性抗原转变为t细胞依赖性抗原，能有效地激发2岁以下儿童以及免疫缺陷者的免疫反应与免疫记忆，且保护时间长。相比多糖疫苗，多糖结合疫苗的覆盖年龄范围更广，免疫效果更好，优势相当明显。因此，采用多价脑膜炎球菌多糖结合疫苗来预防流行性脑膜炎是现如今最佳医疗的策略。
2、但目前脑膜炎球菌多价结合疫苗常采用单载体蛋白，而同一种载体蛋白在多价结合疫苗中会竞争辅助型t细胞，进而对多糖免疫应答产生抑制作用，因此，为提高多价结合疫苗的免疫原性，本技术提出一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品。
技术实现思路
1、本技术的主要目的是提供一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法及其产品，旨在解决现有的脑膜炎球菌多价结合疫苗免疫原性不高的技术问题。
2、为实现上述目的，本技术提出了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，包括以下步骤：
3、将a群脑膜炎球菌多糖原液和c群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到a、c群多糖解聚液；
4、调节所述a、c群多糖解聚液的ph至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到a、c群多糖衍生物；
5、将所述a、c群多糖衍生物与cp1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到a、c群多糖-cp1结合物；
6、将x群脑膜炎球菌多糖原液、y群脑膜炎球菌多糖原液和w135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到x、y、w135群多糖解聚液；
7、调节所述x、y、w135群多糖解聚液的ph至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到x、y、w135群多糖氧化物；
8、将所述x、y、w135群多糖氧化物与crm197蛋白浓缩液混合，调节ph呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液；
9、分别将所述a、c群多糖-cp1结合物与所述x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液；将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
10、可选地，所述将a群脑膜炎球菌多糖原液和c群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到a、c群多糖解聚液的步骤，包括：
11、将a群脑膜炎球菌多糖原液和c群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使a群脑膜炎球菌多糖和c群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到a、c群多糖解聚液。
12、可选地，所述调节所述a、c群多糖解聚液的ph至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到a、c群多糖衍生物的步骤，包括：
13、在所述a、c群多糖解聚液中加入naoh溶液，调节ph为9.0-10.0，再加入1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐进行羟基活化3min-5min，再加入己二酸二酰肼过夜反应后，经膜包超滤，得到a、c群多糖衍生物。
14、可选地，所述将所述a、c群多糖衍生物与cp1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到a、c群多糖-cp1结合物的步骤，包括：
15、将所述a、c群多糖衍生物与cp1蛋白混合，调节ph为5.5-6.5，加入4-(4,6-二甲氧基三嗪)-4-甲基吗啉盐酸盐，并于20℃-30℃下搅拌反应4h-6h，再超滤后，得到a、c群多糖-cp1结合物。
16、可选地，所述将x群脑膜炎球菌多糖原液、y群脑膜炎球菌多糖原液和w135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到x、y、w135群多糖解聚液的步骤，包括：
17、将x群脑膜炎球菌多糖原液、y群脑膜炎球菌多糖原液和w135群脑膜炎球菌多糖原液一同在1100bar-1300bar的压强下，超声循环解聚5次-20次，使x群脑膜炎球菌多糖、y群脑膜炎球菌多糖和w135群脑膜炎球菌多糖的分子量均为5万-10万，得到x、y、w135群多糖解聚液。
18、可选地，所述调节所述x、y、w135群多糖解聚液的ph至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到x、y、w135群多糖氧化物的步骤，包括：
19、在所述x、y、w135群多糖解聚液中加入醋酸-醋酸铵缓冲液，调节ph至4.7-4.9，再加入高碘酸钠溶液，混匀后，在25℃恒温水浴下氧化22h-26h，再采用10kd的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后浓缩，得到x、y、w135群多糖氧化物。
20、可选地，所述将所述x、y、w135群多糖氧化物与crm197蛋白浓缩液混合，调节ph呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液的步骤，包括：
21、将所述x、y、w135群多糖氧化物与crm197蛋白浓缩液混合，再加入磷酸氢二钠溶液，调节ph至6.1-6.3，在25℃水浴条件下反应1.5h-2.5h，反应完成后，加入氰基硼氢化钠，在25℃水浴条件下反应46h-50h，再采用50kd的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，再加入氰基硼氢化钠进行封端反应，反应结束后，再采用50kd的超滤离心管并加注射用水换液至6-8倍体积后，得到x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液。
22、可选地，所述分别将所述a、c群多糖-cp1结合物与所述x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液的步骤，包括：
23、分别将所述a、c群多糖-cp1结合物与所述x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液通过4ff凝胶色谱柱进行层析纯化，经过洗脱后，收集洗脱峰部分，并使用注射用水进行超滤换液，再采用0.22μm滤膜过滤后，进行混合，并于2℃-8℃下保存，得到多糖结合物原液。
24、可选地，所述将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗的步骤，包括：
25、在所述多糖结合物原液中加入冻干蔗糖保护剂与注射用水，采用0.22μm针头滤器除菌过滤，再分装、冻干后，得到成品多糖结合疫苗。
26、本技术还提出了一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗产品，采用上述基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法所得。
27、本技术至少具有以下有益效果：
28、本技术为制备五价结合疫苗，首先将a群脑膜炎球菌多糖和c群脑膜炎球菌多糖解聚成较小的分子量，适宜的分子量有利于脑膜炎球菌多糖与载体蛋白的结合，再对a、c群多糖上的羟基进行活化，以便于连接剂通过活化的羟基连接到脑膜炎球菌多糖上，再选取cp1蛋白作为载体蛋白，在缩合剂的催化作用下，使a、c群多糖衍生物与cp1蛋白发生缩合反应，即可得到a、c群多糖-cp1结合物，再将x群脑膜炎球菌多糖、y群脑膜炎球菌多糖和w135群脑膜炎球菌多糖解聚成适宜的分子量，并对解聚后的x、y、w135群脑膜炎球菌多糖进行氧化，使多糖上的羟基被氧化成醛基，再选取crm197蛋白作为载体蛋白，使x、y、w135群多糖氧化物与crm197蛋白结合并形成席夫碱结构，再以氰基硼氢化钠作为还原剂，使席夫碱结构还原为c-n键，从而得到x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物，再分别将a、c群多糖-cp1结合物与x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物纯化后混合，得到多糖结合物原液，经除菌、过滤、冻干后，即可得到含a群、c群、x群、y群、w135群血清的脑膜炎球菌五价结合疫苗。本技术采用cp1蛋白和crm197蛋白共同作为载体蛋白，可避免同一种载体蛋白在多价结合疫苗中会竞争辅助型t细胞而对多糖免疫应答产生抑制作用，相比于单载体蛋白的多价结合疫苗，本技术具有更高的免疫原性，且含有a群、c群、x群、y群和w135群五种血清型，血清型数量的增加，进一步提高了多糖结合疫苗的免疫原性。
1.一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将a群脑膜炎球菌多糖原液和c群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到a、c群多糖解聚液的步骤，包括：
3.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述调节所述a、c群多糖解聚液的ph至碱性后，加入活化剂进行羟基活化，再加入连接剂进行衍生，经超滤后，得到a、c群多糖衍生物的步骤，包括：
4.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述a、c群多糖衍生物与cp1蛋白在缩合剂的作用下发生缩合反应，再超滤后，得到a、c群多糖-cp1结合物的步骤，包括：
5.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将x群脑膜炎球菌多糖原液、y群脑膜炎球菌多糖原液和w135群脑膜炎球菌多糖原液一同解聚，得到x、y、w135群多糖解聚液的步骤，包括：
6.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述调节所述x、y、w135群多糖解聚液的ph至酸性后，加入氧化剂进行氧化，经超滤浓缩后，得到x、y、w135群多糖氧化物的步骤，包括：
7.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述x、y、w135群多糖氧化物与crm197蛋白浓缩液混合，调节ph呈酸性，再加入氰基硼氢化钠进行反应，经超滤后，得到x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液的步骤，包括：
8.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述分别将所述a、c群多糖-cp1结合物与所述x-crm197、y-crm197、w135-crm197结合物溶液进行纯化后混合，得到多糖结合物原液的步骤，包括：
9.根据权利要求1所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述将所述多糖结合物原液除菌、过滤、冻干后，得到成品多糖结合疫苗的步骤，包括：
10.一种基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗产品，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的基于双蛋白载体的五价脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法所得。
