本发明涉及使用纳米孔技术检测样品中的分子的多重方法。本发明也涉及用于结合和识别分子的载体、此类载体的群体以及包括此类载体的试剂盒和系统。
背景技术：
1、生物传感器是医学诊断的重要部分并且是快速发展行业的一部分。目前用于生物标志物(例如，蛋白质)感测的最先进的检测技术通常与通过elisa测定的定量光学读数或定性颜色读数相结合，并且受限于低浓度，这掩盖了稀少事件。基于抗体的检测技术通常在范围上受限于多肽靶标，并且在低浓度下灵敏度低。基于质谱(ms)的技术通常需要大量的样品制备，并且也可能在低浓度下灵敏度低，而如果要分析多个靶标，靶向ms技术则需要大样品量。
2、纳米孔技术先前已经用于检测非多核苷酸分子。wo 2013/121201描述了使用包括适体的探针和跨膜孔技术来确定一种或多种分子的存在或不存在的方法，并举例说明了对凝血酶的检测。dna载体先前已经用于实现对靶标的选择性、无标记检测，但仅限于单一分析物并且不能轻易扩展(参见，例如，sze等人“nature comms 8.1(2017):1-10，以及cai等人nature comms 10.1(2019):1-9)。
3、此外，一些生物标志物群体，例如，mirna群体具有短寿命并且以低浓度存在，这意味着它们目前在临床上无法获得。
4、因此，需要能够实现同时检测复杂样品(诸如生物体液)中的多种可溶性蛋白质、mirna和其他分子(诸如生物标志物)的分析方法。此外，也需要此类技术能够检测非常低浓度的靶分子。能够实现该目标的技术有望产生深远的影响，例如，在医疗保健领域用于诊断和监测疾病进展。此类技术也可以在不同领域得到应用，诸如针对污染物或其他杂质的存在研究水样。
技术实现思路
1、本公开涉及利用纳米孔技术等来检测蛋白质、mirna和其他生物标志物以及其他类型的分子的方法。该技术具有以高灵敏度和快速读数直接在未处理的样品中进行高度多重检测的潜力。
2、因此，本文提供了：
3、-一种用于检测样品中的多种分子的方法，该方法包括：
4、(a)使该样品与载体和纳米孔接触，其中该载体包括单链前导区、标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结合区，并且其中马达蛋白与该载体结合使得其可以控
5、制该标识符区在该纳米孔内的移动；
6、(b)当载体在该纳米孔内移动时进行一种或多种光学或电学测量，以表征该标识
7、符区并确定该分子是否与该分子结合区结合；
8、-载体，其包括单链前导区、标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结合区，其中马达蛋白在该单链前导区与该标识符区之间的位置处与该载体结合；
9、-用于多种分子的载体群体，其中每个载体包括单链前导区、标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结合区，其中马达蛋白在该单链前导区与该标识符区之间的位置处与该载体结合，并且该群体中的不同载体包括不同标识符区和不同分子结合区；
10、-一种用于检测样品中的多种分子的试剂盒，该试剂盒包括：
11、(i)载体群体，其中每个载体包括标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结
12、合区，并且该群体中的不同载体包括不同标识符区和不同分子结合区；
13、(ii)包括单链前导区的衔接子；以及
14、(ii)马达蛋白；以及
15、-一种用于检测样品中的多种分子的系统，该系统包括：
16、(i)载体群体，其中每个载体包括单链前导区、标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结合区，其中马达蛋白在该单链前导区与该标识符区之间的位置处与该载体结合，并且该群体中的不同载体包括不同标识符区和不同分子结合区；以及
17、(iii)纳米孔。
1.一种用于检测样品中的多种分子的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体进一步包括在所结合的马达蛋白与所述分子结合区之间的间隔子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述载体依次包括单链前导区、标识符区、间隔子和分子结合区。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述分子结合区和/或所述标识符区是多核苷酸。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子结合区或其部分是所述标识符区。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述标识符区是多核苷酸并且包括条形码序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述载体包括多于一个标识符区和/或多于一个分子结合区。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述载体包括多于一个标识符区，并且所述方法用于检测多个样品中的多种分子，所述载体中的一个标识符区对于所述样品是唯一的，并且所述载体中的一个标识符区对于与所述载体结合的所述分子是唯一的。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子包括神经递质、蛋白质和/或mirna。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子结合区是适体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子结合区是抗体、抗体片段、纳米抗体或亲和体。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子结合区与mirna互补。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述标识符区是多核苷酸，并且所述方法包括：确定所述标识符区的多核苷酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于检测所述分子的存在或不存在。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法用于测定所述分子的浓度。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多种分子是10种或更多种不同分子。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述马达蛋白是解旋酶、聚合酶、核酸酶、转位酶或拓扑异构酶。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纳米孔是蛋白质孔、固态孔或dna折纸孔。
19.一种载体，其包括单链前导区、标识符区和对待检测分子具有特异性的分子结合区，其中马达蛋白在所述单链前导区与所述标识符区之间的位置处与所述载体结合。
20.根据权利要求19所述的载体，其进一步包括在所述标识符区与所述分子结合区之间的间隔子和/或与所述分子结合区特异性结合的分子。
21.一种用于多种分子的载体群体，其中所述载体如权利要求19或20所定义，并且所述群体中的不同载体包括不同标识符区和不同分子结合区。
22.一种用于检测样品中的多种分子的试剂盒，所述试剂盒包括：
23.一种用于检测样品中的多种分子的系统，所述系统包括：
