本发明涉及生物工程，更具体地，涉及固定化糖苷酶及其制备方法、应用和试剂盒。
背景技术：
1、固定化酶(immobilized enzyme)是20世纪60年代发展起来的酶催化技术，即将酶分子固定在一定的空间范围内起催化作用。经过固定化处理后的酶蛋白分子仍然保持了原本的催化活性，但由于固相载体的存在，酶蛋白在一定程度上增加了其稳定性，与溶液化的酶相比在使用和储存特性上均有一定的提升。同时，固定化酶由于其改变了酶与底物反应的空间特性，使得酶蛋白分子在催化反应完成后，能够通过简单的处理手段从反应体系中去除，增加了反应的可控性。分离出体系的酶由于其稳定性的增加，能够被再次投入新的反应体系中进行重复使用。
2、根据固定化酶制备手段的不同，实现固定化酶制备的方法主要有：吸附法、包埋法、共价键结合法、肽键结合法和交联法。不同的制备方法产生的固定化效果也不相同，各有优劣。如：吸附法制备容易，能够再生，但结合程度较低，活力回收率低，而包埋法结合程度高，活力回收率高，但制备较难,不能再生。根据固定化酶的具体用途，可以选择不同的制备手段以实现催化反应的最终目的。
3、同时，固定化载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。酶蛋白的活性中心决定了其催化效率，酶蛋白的空间结构对酶活性也起到了至关重要对影响，因而在固定化的过程中必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响，而且要避免酶蛋白高级结构的破坏。从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为无机载体、高分子载体、复合载体及新型载体等。
4、固定化酶的应用领域具有多样性，涉及：食品工业、医学、临床分析、环保技术和能源利用等。在现代医学研究和药品制备中，许多疾病与酶密切相关。由于酶在进入人体后的稀释作用，不能以最佳浓度聚集于靶器官或组织。而固定化酶则能克服这一缺点。如固定在纳米微电极上的葡萄糖氧化酶，可以在活体检测中发挥巨大的作用。在工业生产中，聚丙烯酰胺原位固定化碱性蛋白酶水凝胶球体，则可直接应用到洗涤剂的制备中。而在食品行业中，固定化酶技术的应用更为广泛。如固定化乳糖酶的利用，大大增加了乳糖水解的效率。从黑曲霉发酵液中提取出的β-葡萄糖苷酶经过固定化后，广泛应用在茶叶的改良技术中。固定化果胶酶的应用，则可大大提高果汁的榨汁率。
5、endo-β-n-乙酰葡糖胺糖苷酶(ec 3.2.1.96,engase)是一类能水解糖蛋白或糖肽类n-连接寡糖的n,n'-二乙酰壳聚糖基团上的糖苷键的酶。根据研究报道，除了水解活性外，一些engase(endo-a,endo-m和endo-s)也具有糖基转移酶活性。这些酶已用于许多催化反应制备糖链均一型糖蛋白或糖肽。由于水解活性和转糖活性的同时存在，有必要将这些酶从反应体系中及时分离出来，从而避免酶活性的交叉作用，提升反应底物的产量。
6、现有的固定化脂肪酶，商业化应用使用的多为树脂材料或者多孔材料，其载体价格偏高，在应用上受到了成本因素的制约。
7、此外，溶液化糖苷酶的应用已经在实验层面被证明可行，但是糖工程抗体的工业化制备必定会存在溶液酶的去除以及残留的检测。使用溶液化的糖苷酶在催化化学酶法的去糖与转糖反应之后，抗体作为产物则需要通过纯化手段提纯，而无论何种手段的纯化步骤均不可避免的会存在酶的残留。这在一定程度上降低了方法商业化的可行性。在糖工程抗体制备过程中，由于糖苷酶游离在反应体系中，制备过程需要分步纯化抗体从而将酶蛋白从体系中去除。纯化步骤复杂且容易造成抗体产物损失。同时如果纯化效率不高导致部分游离酶残留在反应体系中，会在转糖基过程中影响最终抗体产率。酶蛋白的储存和消耗同时也影响了该糖基化改造的产业化。酶蛋白保存过程中活性的降低，酶的用量等均会产生较高等成本。
8、因此，如何提供分离方便、稳定性好、可重复利用、成本低的固定化糖苷酶成为本领域亟需解决的技术难题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种固定化糖苷酶及其制备方法、应用和试剂盒，以克服上述问题。
2、根据本发明的第一方面，提供了一种固定化糖苷酶，包括载体材料以及固定在所述载体材料的表面的糖苷酶；
3、所述载体材料为磁性纳米微粒。
4、优选地，所述磁性纳米微粒包括fe3o4磁性纳米微粒。
5、优选地，所述磁性纳米微粒的粒径为10-20nm。
6、优选地，所述糖苷酶包括endo-m，endo-s(wt)，endo-s(d233q)和endo-a(wt)中的任一种。
7、根据本发明的第二方面，提供了一种所述的固定化糖苷酶的制备方法，包括：
8、将羧酸化磁性纳米微粒与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液混合进行活化，清洗后与含有所述糖苷酶的溶液混合，孵育后磁力分离得到所述固定化糖苷酶。
9、优选地，所述羧酸化磁性纳米微粒使用前进行前处理：
10、使用mes缓冲液清洗所述羧酸化磁性纳米微粒，然后磁力分离。
11、优选地，所述活化在室温下进行，时间为0.3-0.6h。
12、优选地，所述孵育的温度为4℃，时间为10-14h。
13、根据本发明的第三方面，提供了一种所述的固定化糖苷酶在糖工程抗体制备中的应用。
14、在fc段糖链均一型糖工程抗体的制备过程中，本技术首先使用野生型endo-s(wt)糖苷酶将抗体fc段非均一性糖基水解切除，经过纯化手段获得去糖基化的抗体。再使用endo-s突变体酶d233q，将均一型糖链转移至抗体fc段。从而实现糖链均一型糖工程抗体的制备。本技术通过固定化的糖苷酶催化反应的应用，实现糖工程抗体的制备，简化制备手段，增加酶稳定性，实现酶的可重复利用。
15、使用溶液化的酶需要在反应体系中分步进行反应，结合纯化步骤获得产物。而固定化酶的应用则可以开发更为便捷的连续流反应体系，将固定化酶进行填柱，使反应物从一端输入，产物从另一端输出。该思路在糖工程抗体的工业化制备以及相关adc的工业化制备中具有巨大的应用价值。
16、根据本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，包括所述的固定化糖苷酶。
17、根据本发明公开的技术内容，具有如下有益效果：
18、本技术提供的固定化糖苷酶，以磁性纳米微粒为载体材料，固定糖苷酶，所得固定化糖苷酶的稳定性好，可以通过磁性分离的方式快速便捷的从反应体系中分离出来，并经过简单的处理直接应用在新的反应中，可重复多次使用。
19、本技术提供的固定化糖苷酶的制备方法，操作简单，所得固定化糖苷酶稳定性好。
20、该固定化酶在糖工程抗体制备中的应用，大大降低了糖工程抗体的制备难度，增加了酶蛋白的稳定性，减少了反应体系的酶蛋白残留。
21、本技术提供的试剂盒，通过固定化糖苷酶实现对单抗、抗体fc片段、糖蛋白及糖肽糖基化分析。
22、通常来讲，采用固定化的酶去除糖链并纯化获得糖链产物，采用质谱、hplc及sds-page等手段对产物进行分析。
23、通过以下参照附图对本发明的示例性实施例的详细描述，本发明的其它特征及其优点将会变得清楚。
1.一种固定化糖苷酶，其特征在于，包括载体材料以及固定在所述载体材料的表面的糖苷酶；
2.根据权利要求1所述的固定化糖苷酶，其特征在于，所述磁性纳米微粒包括fe3o4磁性纳米微粒。
3.根据权利要求2所述的固定化糖苷酶，其特征在于，所述磁性纳米微粒的粒径为10nm-20nm。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固定化糖苷酶，其特征在于，所述糖苷酶包括endo-m，endo-s(wt)，endo-s(d233q)和endo-a(wt)中的任一种。
5.一种权利要求1-4任一项所述的固定化糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述羧酸化磁性纳米微粒使用前进行前处理：
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述活化在室温下进行，时间为0.3h-0.6h。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述孵育的温度为3℃-5℃，时间为10h-14h。
9.一种权利要求1-3任一项所述的固定化糖苷酶在糖工程抗体制备中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的固定化糖苷酶。
