本发明涉及一种假腺管期胚胎肺类器官培养液及培养方法，属生物。
背景技术：
1、人气道主要由各级支气管组成，可以将气体导入和导出，并且借助粘液包裹和纤毛摆动排出肺内的有害物质。人气道上皮主要包含基底细胞、杯状细胞、club细胞和纤毛细胞，其中基底细胞是成体气道上皮的常驻干细胞。气道上皮细胞的胚胎发育主要分为以下几个阶段：首先胚胎期前肠内胚层肺芽的形成，标志着肺的发生，此时nkx2.1+肺祖细胞获得肺命运；接着进入假腺管期，胎肺开始分支形态发生过程，近端sox2+的气道上皮祖细胞进行增殖分化，逐渐获得p63+的基底细胞命运，此外远端s0x9+sox2+的肺上皮祖细胞逐渐进行增殖和分化，向外呈树枝状延伸，向内也可分化为功能成熟的肺上皮细胞；最后小管期随着最远端气道的形成，肺完成了分支形态的发生，气道上皮细胞也从p63+的基底细胞进一步分化形成杯状细胞、club细胞和纤毛细胞。
2、影响气道的遗传性疾病，如囊性纤维化或原发性纤毛运动障碍，仍然有较高的发病率和死亡率，解析肺发育调控机制，掌握发育调控关键节点，对肺发育缺陷疾病机制以及治疗措施的研发具有重要意义。胚胎肺类器官作为利用胚胎肺上皮祖细胞在体外构建的3d培养的能够自我更新和组装的结构，借助信号通路调控和基因编辑技术，可以在体外模拟气道上皮细胞的发育成熟，为体外研究气道发育以及相关遗传代谢相关性疾病提供一个良好的研究模型。
3、假腺管期胚胎肺类器官及人气道上皮细胞胚胎发育类器官模型构建主要使用流产胎儿肺组织样本或者成人肺部分切除术气道上皮组织分别进行体外类器官模型构建[1][2][3][4]。使用流产胎儿肺组织样本或者成人肺部分切除术气道上皮组织进行类器官培养面临的问题：1、样本获取不易，培养成功率较低，周期较长，成本较高；2、目前尚无假腺管期胎肺类器官体外长期稳定培养方案；3、目前尚无人气道上皮细胞胚胎发育类器官模型培养方案；4.目前尚无基于体外胚胎肺类器官逐步诱导上皮细胞分化至成熟纤毛细胞的方案。
4、参考文献：
5、[1]mz,caritg o,jeng q,johnson ja,sun d,howell kj,brady jl,laresgoiti u,allen g,butler r,zilbauer m,giangreco a,rawlins el.humanembryonic lung epithelial tips are multipotent progenitors that can beexpanded in vitro as long-term self-renewing organoids.elife.2017 jun 30；6:e26575.doi:10.7554/elife.26575.pmid:28665271；pmcid:pmc5555721.
6、[2]miller aj,yu q,czerwinski m,tsai yh,conway rf,wu a,holloway em,walker t,glass ia,treutlein b,camp jg,spence jr.in vitro and in vivodevelopment of the human airway at single-cell resolution.dev cell.2020 apr6；53(1):117-128.e6.doi:10.1016/j.devcel.2020.01.033.epub 2020 feb 27.erratumin:dev cell.2020sep 28；54(6):818.pmid:32109386；pmcid:pmc7396815.
7、[3]sachs n,papaspyropoulos a,zomer-van ommen dd,heo i,l,klay d,weeber f,huelsz-prince g,iakobachvili n,amatngalim gd,de ligt j,vanhoeck a,proost n,viveen mc,lyubimova a,teeven l,derakhshan s,korving j,begthel h,dekkers jf,kumawat k,ramos e,van oosterhout mf,offerhaus gj,wienerdj,olimpio ep,dijkstra kk,smit ef,van der linden m,jaksani s,van de ven m,jonkers j,rios ac,voest ee,van moorsel ch,van der ent ck,cuppen e,vanoudenaarden a,coenjaerts fe,meyaard l,bont lj,peters pj,tans sj,van zon js,boj sf,vries rg,beekman jm,clevers h.long-term expanding human airwayorganoids for disease modeling.embo j.2019 feb 15；38(4):e100300.doi:10.15252/embj.2018100300.epub 2019jan 14.pmid:30643021；pmcid:pmc6376275.
8、[4]zhou j,li c,sachs n,chiu mc,wong bh,chu h,poon vk,wang d,zhao x,wen l,song w,yuan s,wong kk,chan jf,to kk,chen h,clevers h,yuenky.differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerginginfluenza virus.proc natl acad sci u s a.2018 jun 26；115(26):6822-6827.doi:10.1073/pnas.1806308115.epub 2018 jun 11.pmid:29891677；pmcid:pmc6042130.
技术实现思路
1、本发明提供了一种假腺管期胚胎肺类器官培养液及培养方法。
2、本发明提供了一种假腺管期胚胎肺类器官培养液，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
3、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺4-6mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1-1.5mm、y27632 4-6μm、chir99021 2-4μm、a83-01400-600nm、r-spondin1 400-600ng/ml、fgf-7 90-110ng/ml、fgf-10 90-110ng/ml、noggin90-110ng/ml、egf 40-60ng/ml。
4、进一步优选地，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
5、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺5mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1.25mm、y27632 5μm、chir99021 3μm、a83-01 500nm、r-spondin1500 ng/ml、fgf-7 100ng/ml、fgf-10 100ng/ml、noggin 100ng/ml、egf 50ng/ml。
6、本发明提供了一种胚胎肺类器官体外近端气管干细胞诱导培养液，它是近端分化培养基，包含如下浓度的组分：
7、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺4-6mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1-1.5mm、bmp4 90-110ng/ml、tgfβ1 90-110ng/ml；
8、优选地，包含如下浓度的组分：
9、advanced dmem/f12、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺5mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1.25mm、bmp4 100ng/ml、tgfβ1 100ng/ml；
10、本发明提供了一种胚胎肺类器官体外近端气管干细胞向纤毛细胞分化培养液，它是纤毛分化培养基，包含如下浓度的组分：
11、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺4-6mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1-1.5mm、y27632 4-6μm、a83-01 400-600nm、fgf-10 90-110ng/ml、noggin 90-110ng/ml；
12、优选地，包含如下浓度的组分：
13、advanced dmem/f12、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、烟酰胺5mm、n-乙酰基-l-半胱氨酸1.25mm、y27632 5μm、a83-01 1μm、fgf-10 500ng/ml、noggin 100ng/ml。
14、本发明还提供了一种用于假腺管期胚胎肺组织处理的消化液，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
15、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、collagense i 300-500u/ml、y27632 8-10μm、dnase i 400-600nm/ml。
16、进一步优选地，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
17、advanced dmem/f12 1×、glutamax-i 1×、b27 1×、hepes 1×、青霉素/链霉素1×、collagense i 400u/ml、y27632 10μm、dnase i 500nm/ml。
18、本发明提供了一种用于假腺管期胚胎肺类器官培养试剂盒，它包括所述的假腺管期胚胎肺类器官培养液。
19、本发明提供了一种胚胎肺类器官体外成熟纤毛细胞诱导培养试剂盒，它包括所述的胚胎肺类器官体外近端气管干细胞诱导培养液、所述的胚胎肺类器官体外近端气管干细胞向纤毛细胞诱导培养液、所述的消化液。
20、本发明还提供了一种胚胎肺类器官体外纤毛细胞诱导培养方法，它是采用所述的试剂盒培养假腺管期胚胎肺类器官，包括如下步骤：
21、1)假腺管期胚胎肺组织获取：取9-21孕周的流产胎儿的肺组织收集于样本保存液中；
22、2)假腺管期胚胎肺组织消化：采用所述的消化液消化，制备成组织悬液；
23、3)假腺管期胚胎类器官传代扩增：
24、假腺管期胚胎肺类器官原代培养：采用matrigel与步骤2)中获得的组织悬液混匀，接种，加入权利要求1所述的假腺管期胚胎肺类器官培养基培养；
25、假腺管期胚胎肺类器官传代扩增：取培养后的ad+++重悬类器官和基质胶，加入1×triple重悬沉淀，消化，离心，细胞沉淀用ad+++清洗，离心后，细胞沉淀用matrigel重悬，再种植下传，下传比例为1:4-1:6，孵育，待matrigel凝固后，加入所述的假腺管期胚胎肺类器官培养基，每3-4天更换培养基，待培养10天或者直径大小在200μm时进行进一步的类器官的分化诱导；
26、4)胚胎肺类器官向成熟纤毛细胞分化诱导：
27、基于上述3)中传代方法获得胎肺类器官单细胞，并将其种植于培养板后，分三阶段诱导分化，各时期培养基配方如下：
28、day0-day7，采用所述的培养液进行假腺管期胚胎肺类器官完全培养，第4天换液一次，培养7天至类器官直径大小在100-200μm；
29、day8-day10采用所述的近端气管干细胞分化培养基培养；
30、day11-day24采用所述的近端气管干细胞向纤毛分化培养基培养，每4天换液一次。
31、进一步优选地，包括如下步骤：
32、1)假腺管期胚胎肺组织获取：取9-21孕周的流产胎儿的肺组织收集于样本保存液中，4℃运输至实验室处理；
33、2)假腺管期胚胎肺组织消化：
34、将步骤1)获得的假腺管期胚胎肺组织置于含无菌dpbs溶液中清洗，剪切成组织块，然后将组织转移至含1ml权利要求7或8所述的消化液中，置于37度孵箱中消化30min，期间每10min取出吹打一次促进消化，消化后，加入0.5ml胎牛血清终止消化，200g离心3min，再用ad+++洗两次后制备成组织悬液；
35、3)假腺管期胚胎类器官传代扩增：
36、假腺管期胚胎肺类器官原代培养：用提前融化的matrigel与2)中获得的组织悬液混匀，然后接种至24孔板中，每孔含30μl matrigel，接种好后，将24孔板放入37℃培养箱中15min，待matrigel凝固后加入所述的假腺管期胚胎肺类器官培养基，每孔500μl；
37、假腺管期胚胎肺类器官传代扩增：每孔加入1mlad+++重悬类器官和基质胶，离心200g，3min，去上清，加入1ml 1×triple重悬沉淀，于37℃消化3-5min，1ml枪头反复吹打后，离心200g，3min，去上清，细胞沉淀用ad+++清洗，最后一次离心后，细胞沉淀用matrigel重悬后再种植回24孔板，下传比例为1:4-1:6，将24孔板放置于37℃培养箱孵育15min，待matrigel凝固后，加入假腺管期胚胎肺类器官培养基，每孔500μl，每3-4天更换培养基，待培养10天或者直径大小在200μm左右时进行进一步的类器官的传代或者冻存；
38、4)胚胎肺类器官向成熟纤毛细胞分化诱导。
39、本发明能实现假腺管期胚胎肺类器官在体外长期稳定培养、传代及保存。构建假腺管期胚胎肺类器官培养及相应试剂盒。构建基于胚胎肺类器官逐步诱导上皮细胞分化至成熟纤毛细胞模型及相应试剂盒。
40、本发明提供一种利用人流产胚胎肺组织样本进行假腺管期胚胎肺类器官的培养方法，所建立的类器官能够高度模拟假腺管期胚胎肺上皮的细胞结构及功能特点，并能长期稳定传代，保持基因型及表型稳定。在假腺管期胚胎肺类器官培养基础上，构建了基于人胚胎肺类器官逐步诱导上皮细胞分化至成熟纤毛细胞方案，通过分阶段添加肺近端干细胞分化诱导培养因子和纤毛细胞诱导分化培养因子，分阶段在体外再现了人气道上皮细胞从假腺管时期胚胎组织到近端气道祖细胞、成体气道干细胞-基底细胞、最后分化为成熟的气道上皮中纤毛细胞发育全过程，为体外研究人气道发育以及相关遗传代谢相关性疾病提供了优越的体外人源化模型。
41、相较于其他已有的气道类器官培养方案，近端诱导培养基的直接添加会导致细胞的大量死亡，本发明培养方案通过前期七天的增殖培养大大提升了类器官形成率，此外分阶段诱导分化的培养能够诱导分化出大量成熟的纤毛细胞，并且可以实现体外模拟人胚胎肺上皮祖细胞逐步分化为成熟纤毛细胞的发育全过程；可以在类器官水平从基因、蛋白以及结构功能方面，系统的评估人气道上皮细胞胚胎发育过程中各细胞亚型动态变化及其分子机制调控过程，深入挖掘关键因子在发育过程中的调控机制。
1.一种假腺管期胚胎肺类器官培养液，其特征在于：它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
2.根据权利要求1所述的假腺管期胚胎肺类器官培养液，其特征在于：它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
3.一种胚胎肺类器官体外近端气管干细胞诱导培养液，其特征在于：它是近端分化培养基，包含如下浓度的组分：
4.一种胚胎肺类器官体外近端气管干细胞向纤毛分化培养液，其特征在于：它是纤毛分化培养基，包含如下浓度的组分：
5.一种用于假腺管期胚胎肺组织处理的消化液，其特征在于，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
6.根据权利要求5所述的用于假腺管期胚胎肺消化处理的消化液，其特征在于，它是含有如下浓度的组分的基础培养基：
7.一种用于假腺管期胚胎肺类器官培养试剂盒，其特征在于：它包括权利要求1或2所述的假腺管期胚胎肺类器官培养液。
8.一种胚胎肺类器官体外成熟纤毛细胞诱导培养试剂盒，其特征在于：
9.一种胚胎肺类器官体外纤毛细胞诱导培养方法，其特征在于：它是采用权利要求7、8所述的试剂盒培养假腺管期胚胎肺类器官，包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的胚胎肺类器官体外纤毛细胞诱导培养方法，其特征在于：包括如下步骤：
