本发明属于基因工程与蛋白质改造，具体涉及一种α-半乳糖苷酶突变体。
背景技术：
1、α-半乳糖苷酶，又叫蜜二糖酶(α-galactosidase，ec 3.2.1.22)，可以催化不同半乳糖苷底物去除α-1,6-连接的半乳糖残基。α-半乳糖苷酶在自然界中广泛存在，尤其在细菌、真菌、酵母菌等微生物中分布最广。α-半乳糖苷酶的细菌来源有嗜热芽孢杆菌、嗜酸乳酸杆菌、发酵乳杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌等。另外从极端嗜热菌杜氏杆菌及海洋细菌假交替单胞菌也分离得到α-半乳糖苷酶。据报道丝状放线菌当中也含有α-半乳糖苷酶，例如从重红色链丝菌和红色糖多孢菌中可分离得到α-半乳糖苷酶。brouns等从高酸度陆地火山地区发现的超嗜热古生菌硫磺矿硫化叶菌p2也可分离纯化得到α-半乳糖苷酶，这种α-半乳糖苷酶具有极高的热稳定性。此外，在真菌中，米曲霉、烟曲霉、藤仓赤霉、简青霉、嗜热棉毛菌及少孢根霉均可作为α-半乳糖苷酶的来源。wang等从费希新萨托菌中分离得到一种α-半乳糖苷酶，研究结果表明，其对豆制品具有高度专一的水解活性。
2、大豆和其他豆类作为饲料当中丰富的蛋白质来源，其中含有高浓度的可溶性低聚糖如棉子糖和水苏糖等，其在动物胃肠道中不能被彻底消化，这些未消化完全的糖进入动物肠道后会促进有害菌群的增长，引起胀气和胃肠道紊乱，严重损害动物的健康，降低动物饲料的饲用效率。因此，在动物饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂可以将这些多余的糖彻底清除，抑制其在肠道中发酵，减轻动物胃肠道胀气症状，避免有害致病菌对动物肠道的损害，提高动物的免疫力，增加动物肠道对营养物质的吸收，提高饲料利用率。
3、例如，baucells等在生长猪和肥育猪的饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，研究结果表明，与对照组相比试验组生长猪和肥育猪的体重明显增加，各项指标明显提升。ghazi等在肉鸡大豆饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂，结果表明，肉鸡对大豆饲料的消化效率提高，增加了大豆饲料的营养价值。戴求仲等在饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂研究其对黄羽肉鸡生产性能的影响，结果表明，添加酶制剂后可以降解饲料中的α-半乳糖苷，改变肠道底物组成，促进有益菌的生长，抑制有害菌的生长，改善肉鸡生长状况，能够明显降低肉鸡后期和全期料重比，改善试验鸡生产性能。缪志军等在饲料中添加α-半乳糖苷酶制剂研究其对番鸭增重和生产性能的影响，结果表明，其能够提高番鸭增重，改善生产性能。
4、目前在颗粒饲料生产过程中有一个短暂的高温阶段，将α-半乳糖苷酶直接添加到动物饲料中进行制粒，其残留酶活极低，而采用饲料制粒后将α-半乳糖苷酶喷涂到饲料上或拌入到饲料中不仅增加设备投入，而且对酶制剂的稳定性和在饲料中分布的均一性都无法得到很好的保证。因此，提高α-半乳糖苷酶的耐温性具有重要的现实意义。
技术实现思路
1、本发明为解决现有技术问题，提供了一种α-半乳糖苷酶突变体；是在α-半乳糖苷酶ag2的基础上通过大量的突变筛选，最终获得耐热性得到显著提高的突变体，为其在饲料领域的广泛使用奠定了基础。
2、本发明提供了一种α-半乳糖苷酶突变体，其包含与seq id no:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，且与seq id no:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：41、108、146、174、176、201、202、206、211、230、233、239、268、328、347、358、395、397、407、459、462、478、487、502、539、552、577、581、587、601、613、654、659、681、710。
3、在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或至少99％的同一性。
4、在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，或至少99.9％的同一性。
5、在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：s41h、i108v、s146m、a174w、a176m、n201y、v202p、k206y、v211w、a230l、d233s、s239h、a268i、v328i、t347k、t347l、t347q、h358e、t395k、t395r、v397m、n407a、a459c、a462d、a462q、t478k、n487l、q502c、q539m、q539y、a552p、a577s、a581p、a581r、v587t、s601c、g613f、s654l、q659i、q659k、q659m、q681d、q681s、s710r。
6、在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代组合：
7、s41h/i108v；
8、s41h/s146m；
9、s41h/a174w；
10、s41h/a176m；
11、s41h/n201y；
12、s41h/v202p；
13、s41h/k206y；
14、s41h/v211w；
15、s41h/a230l；
16、s41h/a268i；
17、s41h/t347k；
18、s41h/h358e；
19、s41h/t395k；
20、s41h/n407a；
21、s41h/n487l；
22、s41h/q502c；
23、s41h/q539y；
24、s41h/a552p；
25、s41h/v587t；
26、s41h/g613f；
27、s41h/s654l；
28、s41h/q659i；
29、s41h/q659m；
30、s41h/q681d；
31、s41h/s710r；
32、v211w/i108v；
33、v211w/s146m；
34、v211w/a174w；
35、v211w/a176m；
36、v211w/n201y；
37、v211w/v202p；
38、v211w/k206y；
39、v211w/a230l；
40、v211w/a268i；
41、v211w/t347k；
42、v211w/h358e；
43、v211w/t395k；
44、v211w/n407a；
45、v211w/n487l；
46、v211w/q502c；
47、v211w/q539y；
48、v211w/a552p；
49、v211w/a581r；
50、v211w/v587t；
51、v211w/g613f；
52、v211w/s654l；
53、v211w/q659i；
54、v211w/q659m；
55、v211w/q681d；
56、v211w/s710r；
57、a459c/i108v；
58、a459c/s146m；
59、a459c/a174w；
60、a459c/a176m；
61、a459c/n201y；
62、a459c/v202p；
63、a459c/k206y；
64、a459c/a230l；
65、a459c/a268i；
66、a459c/t347k；
67、a459c/h358e；
68、a459c/t395k；
69、a459c/n407a；
70、a459c/n487l；
71、a459c/q502c；
72、a459c/q539y；
73、a459c/a552p；
74、a459c/a581r；
75、a459c/v587t；
76、a459c/g613f；
77、a459c/s654l；
78、a459c/q659i；
79、a459c/q659m；
80、a459c/q681d；
81、a459c/s710r；
82、n487l/i108v；
83、n487l/s146m；
84、n487l/a174w；
85、n487l/a176m；
86、n487l/n201y；
87、n487l/v202p；
88、n487l/k206y；
89、n487l/a230l；
90、n487l/a268i；
91、n487l/t347k；
92、n487l/h358e；
93、n487l/t395k；
94、n487l/n407a；
95、n487l/q502c；
96、n487l/q539y；
97、n487l/a552p；
98、n487l/a581r；
99、n487l/v587t；
100、n487l/g613f；
101、n487l/s654l；
102、n487l/q659i；
103、n487l/q659m；
104、n487l/q681d；
105、n487l/s710r；
106、a581r/i108v；
107、a581r/s146m；
108、a581r/a174w；
109、a581r/a176m；
110、a581r/n201y；
111、a581r/v202p；
112、a581r/k206y；
113、a581r/a230l；
114、a581r/a268i；
115、a581r/t347k；
116、a581r/h358e；
117、a581r/t395k；
118、a581r/n407a；
119、a581r/a462q；
120、a581r/q502c；
121、a581r/q539y；
122、a581r/a552p；
123、a581r/v587t；
124、a581r/g613f；
125、a581r/s654l；
126、a581r/q659i；
127、a581r/q659m；
128、a581r/q681d；
129、a581r/s710r；
130、s41h/i108v/s146m；
131、s41h/i108v/a174w；
132、s41h/s146m/a174w；
133、s41h/s146m/d233s；
134、s41h/s146m/s239h
135、i108v/s146m/n407a/v587t；
136、i108v/s146m/d233s/v587t；
137、i108v/s146m/v328i/h358e；
138、i108v/s146m/d233s/v397m；
139、i108v/s146m/a459c/q502c；
140、a268i/h358e/n407a；
141、a268i/t347k/h358e/n407a；
142、a268i/t347k/h358e/t395k；
143、a268i/t347k/h358e/v587t；
144、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c；
145、s41h/i108v/s146m/a174w；
146、s41h/i108v/s146m/a174w/d233s；
147、s41h/i108v/s146m/a174w/d233s/s239h；
148、s41h/i108v/s146m/d233s；
149、s41h/i108v/s146m/v328i；
150、s41h/i108v/s146m/h358e；
151、s41h/i108v/s146m/n407a；
152、s41h/i108v/s146m/v587t；
153、s41h/i108v/s146m/n407a/v587t；
154、s41h/i108v/s146m/d233s/v587t；
155、s41h/i108v/s146m/v328i/h358e；
156、s41h/i108v/s146m/d233s/v397m；
157、s41h/i108v/s146m/a459c/q502c；
158、s41h/i108v/s146m/v328i/a459c/q502c；
159、s41h/i108v/s146m/h358e/a459c/q502c；
160、s41h/i108v/s146m/v328i/h358e/a459c/q502c；
161、s41h/i108v/s146m/d233s/v397m/v587t；
162、s41h/i108v/s146m/n407a/a459c/q502c；
163、s41h/i108v/s146m/d233s/v397m/a459c/q502c；
164、s41h/i108v/s146m/h358e/n407a/v587t；
165、s41h/i108v/s146m/n407a/a459c/q502c/v587t；
166、s41h/i108v/s146m/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
167、i108v/s146m/v328i/a459c/q502c；
168、i108v/s146m/h358e/a459c/q502c；
169、i108v/s146m/v328i/h358e/a459c/q502c；
170、i108v/s146m/d233s/v397m/v587t；
171、s146m/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
172、s146m/a176m/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
173、s146m/n201y/v202p/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
174、s146m/k206y/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
175、s146m/v211w/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
176、s146m/a230l/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
177、s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
178、a268i/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
179、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
180、a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t；
181、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；
182、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/t478k/q502c/v587t；
183、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/n487l/q502c/v587t；
184、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/q539y/v587t；
185、a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；
186、h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
187、h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t；
188、h358e/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；
189、h358e/n407a/a459c/t478k/q502c/v587t；
190、h358e/n407a/a459c/n487l/q502c/v587t；
191、h358e/n407a/a459c/q502c/q539y/v587t；
192、h358e/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；
193、s41h/t95k/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
194、s41h/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；
195、s41h/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/t478k/q502c/v587t；
196、s41h/i108v/s146m/t347k/h358en407a/a459c/n487l/q502c/v587t；
197、s41h/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/q539y/v587t；
198、s41h/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；
199、s41h/i108v/s146m/a176m/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
200、s41h/i108v/s146m/n201y/v202p/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
201、s41h/i108v/s146m/k206y/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
202、s41h/i108v/s146m/v211w/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
203、s41h/i108v/s146m/a230l/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
204、s41h/i108v/s146m/a268i/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
205、s41h/i108v/s146m/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
206、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
207、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t；
208、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；
209、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/t478k/q502c/v587t；
210、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/n487l/q502c/v587t；
211、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/q539y/v587t；
212、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；s41h/i108v/s146m/n201y/v202p/k206y/v211w/h358e/n407a/a459c/q502c/v587t；
213、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/n487l/q502c/a552p/v587t；
214、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/s710r；i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/n487l/q502c/a552p/v587t；
215、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/g613f/s710r；
216、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/s654l/s710r；
217、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/q659i/s710r；
218、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395/n407a/a459c/q502c/v587tk/q659m/s710r；
219、i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/q681d/s710r；
220、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/n487l/q502c/v587t；
221、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/a462d/q502c/v587t；
222、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t；
223、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/g613f；
224、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/s654l；
225、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/q659i；
226、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395/n407a/a459c/q502c/v587tk/q659m；
227、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/q681d；
228、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/v587t/s710r；
229、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/q659i；
230、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395/n407a/a459c/q502c/a552p/v587tk/q659m；
231、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/q681d；
232、s41h/i108v/s146m/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/s710r；
233、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/n487l/q502c/a552p/v587t；
234、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/a462d/q502c/a552p/v587t；
235、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/a552p/v587t；
236、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/g613f；
237、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/s654l；
238、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v587t/q659i；
239、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395/n407a/a459c/q502c/a552p/v58
240、7tk/q659m；
241、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v
242、587t/q681d；
243、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v
244、587t/s710r；
245、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v
246、587t/s654l/s710r；
247、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v
248、587t/q659i/s710r；
249、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395/n407a/a459c/q502c/a552p/v58
250、7tk/q659m/s710r；
251、i108v/s146m/v211w/a268i/t347k/h358e/t395k/n407a/a459c/q502c/a552p/v
252、587t/q681d/s710r；
253、s41h/i108v/s146m/n201y/v202p/k206y/v211w/h358e/n407a/a459c/q502c/a5
254、52p/a581r/v587t/q681d；
255、s41h/i108v/s146m/n201y/v202p/k206y/v211w/h358e/n407a/a459c/q502c/a5
256、52p/v587t/q659i/s710r。
257、本发明还涉及编码上述α-半乳糖苷酶突变体的dna分子。
258、本发明还涉及包含上述dna分子的重组表达载体。
259、本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
260、所述宿主细胞为毕赤酵母(pichia pastoris)。
261、所述宿主细胞为黑曲霉(aspergillus niger)。
262、所述宿主细胞为里氏木霉(trichoderma reesei)。
263、本发明以野生型α-半乳糖苷酶ag2为基础，提供了包含至少一个选自s41h、i108v、s146m、a174w、a176m、n201y、v202p、k206y、v211w、a230l、d233s、s239h、a268i、v328i、t347k、t347l、t347q、h358e、t395k、t395r、v397m、n407a、a459c、a462d、a462q、t478k、n487l、q502c、q539m、q539y、a552p、a577s、a581p、a581r、v587t、s601c、g613f、s654l、q659i、q659k、q659m、q681d、q681s、s710r所述突变位点的α-半乳糖苷酶突变体。与α-半乳糖苷酶ag2相比，本发明提供的突变体耐热性得到显著提升。其中，本发明提供的包含上述单个突变位点的突变体，在67℃条件下处理3min后，其酶活残留率高达40.42％-72.06％，比野生型提高了10.47％-96.94％；本发明提供的包含上述至少两个突变位点的突变体，在68℃条件下处理3min后，酶活残留率达到24.92％-64.21％，比野生型提高了113.4％-449.7％。
264、综上，与α-半乳糖苷酶ag2相比，本发明提供的所述单点突变体及组合突变体的耐热性得到显著提升，从而有利于α-半乳糖苷酶在饲料中的广泛应用。
1.一种α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与seq id no:2具有至少90%同一性的氨基酸序列，且与seq id no:2相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：41、108、146、174、176、201、202、206、211、230、233、239、268、328、347、358、395、397、407、459、462、478、487、502、539、552、577、581、587、601、613、654、659、681、710。
2.如权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求2所述的α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与seq id no:2相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：s41h、i108v、s146m、a174w、a176m、n201y、v202p、k206y、v211w、a230l、d233s、s239h、a268i、v328i、t347k、t347l、t347q、h358e、t395k、t395r、v397m、n407a、a459c、a462d、a462q、t478k、n487l、q502c、q539m、q539y、a552p、a577s、a581p、a581r、v587t、s601c、g613f、s654l、q659i、q659k、q659m、q681d、q681s、s710r。
5.如权利要求1所述的α-半乳糖苷酶突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代组合：
6.编码权利要求1-5任一所述α-半乳糖苷酶突变体的dna分子。
7.包含权利要求6所述dna分子的重组表达质粒。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达质粒；所述的宿主细胞为非植物细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）、黑曲霉（aspergillus niger）或里氏木霉（trichoderma reesei）中的任意一种。
10.权利要求1-5任一所述α-半乳糖苷酶突变体在饲料生产中的应用。
