本发明属于兽医生物，具体地，公开了一种用于构建新城疫7型致弱病毒重组疫苗株的基因片段及应用。
背景技术：
1、目前新城疫的重组疫苗采用反向遗传操作技术构建，反向遗传操作技术(reversegenetics manipulation technique)是指在体外通过构建rna病毒的感染性分子克隆，将病毒基因组rna逆转录成cdna，在dna分子水平上对其进行各种体外人工操作，由病毒基因组cdna和各种辅助蛋白来组装新的rna病毒的一项研究技术，也叫全长感染性cdna克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。由于最终“拯救”出的rna病毒来源于cdna克隆，因此，可通过中间过程中人为加入的dna环节，在dna水平上对rna病毒基因组进行各种体外人工操作，如进行基因突变、基因敲除(缺失)、基因插入、基因置换和基因互补(即构建嵌合病毒)等改造，解决了对rna病毒基因组难以操作这一难题，极大地方便了人们进行病毒各基因的功能、致病机理和病毒病防制策略的研究，同时为新型疫苗的研制和开发提供了新的思路。新城疫病毒(newcastledisease virus，ndv)是新城疫(nd)的病原体。ndv宿主范围较广，其中鸡为最易感动物，ndv只有一个血清型，对ndv病毒f基因进行遗传进化分析，可将其分为class i和class ii两个类群，class ii至少具有21个基因型(i-xxi)。吉林大学薛聪等对2013-2017年东北地区禽源ndv分离株基因进行分析，发现ndv主要流行毒株基因型为基因vii型。病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的rna病毒，基因组结构模式为：3′-np-p-m-f-hn-l-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(np)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)、融合蛋白(f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(hn)和大分子蛋白(l)即核蛋白(np)，p，m，f，hn和l蛋白。针对ndv的流行，使用疫苗免疫是防控该疾病传播的有效手段。当前我国对新城疫的防控主要使用以lasota为代表的基因ii型弱毒株制作的疫苗产品，这些疫苗株与基因vii型毒株遗传距离较大，不能完全有效地阻止基因vii型ndv的扩散与传播，免疫鸡易产生食欲废绝、产蛋下降和带毒散度等现象。
2、目前已公布专利有4项，即新城疫病毒重组疫苗a-ndv-lx/i4及构建方法(申请号：201210000697.3)，该专利描述的是以vii型新城病毒js-5-05-go株的f基因与hn基因替换i型新城疫病毒弱毒株ndv/lv的对应部分，并将f基因进行相关修饰后构建的表达基因vii型f和hn的重组新城疫病毒疫苗株a-ndv-lx/i4；重组质粒、重组基因vii型新城疫病毒及其培养方法(申请号：202011642554.3)，该专利描述的是将新城疫病毒基因vii亚型强毒株dhn3株的f基因替换为lasota株的对应部分以及后续处理，以此构建一种重组基因vii型新城疫病毒rfdhn3-s1株；一株重组新城疫病毒弱疫苗株及其构建方法(申请号：202110180374.6)，该专利描述的是将vii型新城疫病毒的np基因替换为ii型新城疫病毒的对应部分，并将f基因进行相应修饰后构建的基因vii型重组新城疫病毒弱疫苗株；一种hn蛋白突变的基因vii型新城疫病毒重组疫苗株(申请号：2021111173227.2)，该专利描述的是以新城疫病毒基因vii.2亚型毒性致弱株的f基因与hn基因替换lasota株基因组的对应部分来构建基因vii型新城疫病毒重组疫苗株rla-vii-yn17株。相比而言，本方案是用目前临床流行的基因vii型新城疫病毒基因全长cdna放置于有cmv启动子序列与sv40 poly(a)信号序列的调控下，同时对f基因的剪切序列直接进行碱基突变，并在p基因和m基因之间插入pme i酶切位点，将含有病毒全长基因的质粒与辅助质粒配合转染bhk-21细胞，以此构建新城疫vii型弱毒株rn7。
技术实现思路
1、本发明提供了一种新城疫病毒基因vii型致弱毒株rn7的制备方法及应用。在建立基因vii型新城疫病毒rn7株的反向遗传操作平台的基础上，将新城疫病毒f蛋白的强毒裂解位点112r-r-r-k-r-f117突变为弱毒株vii.2亚型的f蛋白裂解位点112g-r-q-g-r-l117，并在p基因与m基因之间插入pme i酶切位点，构建出致弱表达ndv基因vii型全长cdna克隆质粒ps-ndv-f-hou,与辅助质粒共转染bhk-21细胞后拯救出重组ndv弱毒疫苗株rn7。灭活乳化制备成弱毒疫苗，动物实验结果显示该疫苗具有良好的免疫原性，适用于大规模的生产制备。
2、本发明的第一个目的是提供一种用于构建新城疫7型致弱病毒重组疫苗株的基因片段，所述基因片段包括含病毒全长cdna序列的基因片段i，基因片段i的3’末端插入了丁型肝炎病毒核酶序列hdv以及sv40 poly(a)信号序列，基因片段i的5’端引入锤头核酸酶序列ham，5’末端插入cmv启动子序列以及三个鸟嘌呤核苷酸，所述基因片段一包含用毒性致弱的vii.2亚型的f蛋白基因片段，和在p蛋白基因片段和m基因蛋白基因片段之间插入了pme i酶切位点后的基因片段ii替换ndv vii型kq03株基因组的对应部分。
3、本发明的另一个目的是提供一种新城疫7型致弱病毒重组疫苗株，所述疫苗是将所述的用于构建新城疫7型致弱病毒重组疫苗株的基因片，与辅助质粒用脂质体转染细胞后遗传拯救的。
4、进一步的，所述细胞为bsr细胞。
5、本发明的另一个目的是提供所述的新城疫7型致弱病毒重组疫苗株在制备疫苗中的应用。
6、本发明的另一个目的是提供一种灭活疫苗，所述的灭活疫苗，其中抗原含有灭活的如权利要求3或4所述的新城疫7型致弱病毒重组疫苗株。
7、本发明的有益效果为：
8、1.本方案使用cmv启动子控制ndv全长基因组的转录过程，无需使用特定表达t7rna聚合酶的细胞或者痘病毒载体，操作简便，病毒拯救效率高，从细胞转染到获得重组病毒只需9天。除本方案外，国内ndv基因vii型灭活疫苗的相关产品主要使用t7启动子序列来调控病毒拯救过程，与cmv启动子相比转录效率较低，可能会降低病毒拯救成功率。
9、2.本方案利用脂质体介导转染包含ndv全长基因组cdna克隆质粒与辅助质粒，操作简便，病毒拯救使用时间较少。
10、3.本方案所提供的重组病毒rn7株灭活疫苗，虽然疫苗株的毒力已经减弱，但仍然保持良好的免疫原性，刺激机体产生有效的免疫应答。
1.一种用于构建新城疫7型致弱病毒重组疫苗株的基因片段，其特征在于，所述基因片段包括含病毒全长cdna序列的基因片段i，基因片段i的3’末端插入了丁型肝炎病毒核酶序列hdv以及sv40 poly(a)信号序列，基因片段i的5’端引入锤头核酸酶序列ham，5’末端插入cmv启动子序列以及三个鸟嘌呤核苷酸，所述基因片段一包含用毒性致弱的vii.2亚型的f蛋白基因片段，和在p蛋白基因片段和m基因蛋白基因片段之间插入了pmei酶切位点后的基因片段ii替换ndv vii型kq03株基因组的对应部分。
2.一种新城疫7型致弱病毒重组疫苗株，其特征在于，所述疫苗是将如权利要求1所述的用于构建新城疫7型致弱病毒重组疫苗株的基因片，与辅助质粒用脂质体转染细胞后遗传拯救的。
3.如权利要求2所述的新城疫7型致弱病毒重组疫苗株，其特征在于，所述细胞为bsr细胞。
4.权利要求2或3所述的新城疫7型致弱病毒重组疫苗株在制备疫苗中的应用。
5.一种灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗，其中抗原含有灭活的如权利要求2或3所述的新城疫7型致弱病毒重组疫苗株。
