本发明属于生物医药工程领域，特别涉及一种佐剂赋能的疫苗组合物及其制备方法和其在免疫治疗及预防领域的应用。
背景技术：
1、传统疫苗包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因重组蛋白疫苗等，多由单一活性成分构成，多采用单一品种佐剂的配方技术，其疫苗制备技术均采用疫苗活性成分制备就绪后，最后添加某一种佐剂方式制成疫苗成品。如灭活病毒疫苗、亚单位疫苗和重组基因工程蛋白疫苗，如果疫苗成分中只有抗原组分，其免疫原性往往较弱，通常需要联合应用佐剂来增强抗原的免疫原性或改变免疫的反应类型，才能起到足够的保护作用。佐剂的选择通常需要结合病原体的特点和免疫保护需要的免疫反应类型来决定，因此，选择适当且对疫苗的免疫原性有增强效用的佐剂对于疫苗的有效性尤其重要。虽然目前铝盐、mf59、as04、as01等佐剂已批准上市用于人用预防性疫苗中，但我国佐剂使用较单一，目前绝大部分含佐剂的疫苗产品中所使用的仍为传统的铝佐剂。铝佐剂作为免疫佐剂已经使用了很长的时间，其安全性与免疫增强作用早已被人们所证实。但也存在一些缺陷，比如在与免疫原性较差的蛋白小分子共同使用时无法产生足够的抗体应答，且细胞免疫方面存在缺陷等。
2、乳剂型佐剂(包括水包油乳剂、油包水乳剂等)是新型佐剂的一个重要分支，乳剂可联合多种弱抗原(重组蛋白、多肽等)使用，并诱发高滴度的抗原特异性抗体。乳剂型佐剂通常包含油相成分、水相成分和乳化剂。其中，水包油乳剂以水相成分为主，人体耐受性较高，且与多数疫苗抗原的相容性较好。
3、尽管乳剂型佐剂和铝佐剂都已经被广泛使用，但不同的组合或制剂方式、施用方式带来的免疫效果可能存在差异。因此，仍然需要有新的免疫制剂和免疫方法，以提供更加安全有效的，方便配制的，成本低廉的，能够快速诱导高效免疫应答的疫苗制剂。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种安全性和免疫刺激活性好，方便配制的，成本低廉的，能够快速诱导高效免疫应答的佐剂赋能的疫苗组合物。同时，本发明提供简便的制备方法和具有广阔前景的应用。
2、为了达到上述目的，本发明一方面提供一种佐剂赋能的疫苗组合物，包含独立包装的第一组分和第二组分，所述第一组分为包含抗原性物质的含或不含佐剂的疫苗成品制剂；所述第二组分为包含水包油乳剂佐剂的赋能佐剂，其中，所述水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80。
3、在一些实施方式中，所述疫苗组合物的第一组分是不含佐剂的疫苗成品制剂。
4、在一些实施方式中，所述疫苗组合物的第一组分是含有佐剂的疫苗成品制剂。
5、在一些实施方式中，本发明所述第一组分指的疫苗成品制剂为包含各种抗原性物质的减毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、基因工程疫苗或核酸疫苗的成品制剂。
6、本文所述的减毒活疫苗是指将病原体经过减毒后，仍然保留其抗原性的疫苗，接种减毒活疫苗后相当于一次隐性感染过程。
7、本文所述的灭活疫苗是对病毒或细菌进行培养，然后用高温处理或化学灭活剂将其灭活，而制备出的疫苗。
8、本文所述的类毒素疫苗是指用丧失毒性而保留免疫原性的毒素所制成的疫苗，例如破伤风类毒素疫苗、白喉类毒素疫苗等。
9、本文所述的亚单位疫苗是通过化学分解或有控制性的蛋白质水解方法，提取细菌、病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段制成的疫苗，也称为组分疫苗。
10、本文所述的载体疫苗是指以减毒活病毒或减毒活细菌为载体，将编码特定病原体免疫原性蛋白的基因插入载体，作为疫苗输入机体可预防特定病原体。
11、本文所述的核酸疫苗分为dna疫苗和mrna疫苗两种。dna疫苗是将重组的dna直接注射到机体内，使其在活体内表达出蛋白抗原，激发机体产生保护性免疫应答。mrna疫苗是指编码抗原蛋白的mrna进入细胞质即可实现靶抗原的表达。
12、本文所述的基因工程疫苗是指利用dna重组技术，把目的基因插入载体dna分子中，然后导入原核或真核细胞表达系统，纯化抗原而制成的疫苗。如目前广泛使用的乙肝基因重组疫苗、hpv疫苗、流感疫苗等。
13、在一些实施方式中，所述第一组分中的抗原性物质可以衍生自病毒，诸如流感病毒、猫白血病病毒、猫免疫缺陷病毒、人hiv-1、hiv-2、2型单纯疱疹病毒、人巨细胞病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、或口蹄疫病毒；也可以衍生自细菌，诸如炭疽、白喉、莱姆病、疟疾、结核病、利什曼病、克氏锥虫(t.cruzi)、埃利希氏体属(ehrlichia)、假丝酵母属(candida)等，或衍生自原生动物诸如牛巴贝虫(babeosisbovis)或疟原虫(plasmodium)。抗原性物质将通常由天然或合成的氨基酸构成，例如呈肽、多肽或蛋白的形式，可以由多糖构成，或者可以是其混合物。抗原可以从天然来源分离，借助固相合成法合成，或者可以通过重组dna技术获得。作为人用疫苗的应用，包括但不限于预防以下疾病的疫苗中，例如流感，霍乱，破伤风，白喉，百日咳，甲肝，乙肝，b型流感嗜血杆菌(hib)感染，流脑(a，b，c，y，w135型)，肺炎，狂犬病，日本脑炎，轮状病毒感染，炭疽，脊髓灰质炎，hpv感染，金黄色葡萄球菌感染，带状疱疹，新型冠状病毒感染等。
14、在一些实施方式中，所述第一组分中的抗原性物质包含人乳头瘤病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、百日咳杆菌抗原、白喉杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、甲型肝炎抗原、乙型肝炎抗原、狂犬病病毒抗原、炭疽杆菌抗原、b型流感嗜血杆菌抗原、肺炎链球菌抗原以及脑膜炎球菌抗原中的一种或多种。
15、在一些实施方式中，所述第一组分是人乳头瘤病毒疫苗成品制剂，例如市售的二价、四价、九价或更高价次的hpv疫苗。
16、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是人乳头瘤病毒抗原。人乳头瘤病毒的衣壳由主要衣壳蛋白l1和次要衣壳蛋白l2组成。已上市疫苗都是基于hpv l1病毒样颗粒(virus-like particle，vlp)为抗原的疫苗，通过基因重组表达的l1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。
17、来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原可以为各型别hpv的l1蛋白和/或l2蛋白。在本发明的实施方式中，hpv可以为低危型hpv(例如hpv6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81、89)，中等风险型hpv(例如hpv26、53、66、73、82)，或者高危型hpv(例如hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)。在优选的实施方式中，所述抗原包含hpv6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型及59型中的一种或多种的l1蛋白和/或l2蛋白。
18、在优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型及59型中的一种或多种的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
19、在一个优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv 6型和11型的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
20、在一个优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv16型和18型的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
21、在一个优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv 6型、11型、16型和18型的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
22、在一个优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv6型、11型、16型、18型、31型、33型、45型、52型及58型的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
23、在一个优选的实施方式中，来源于人乳头瘤病毒(hpv)的抗原包含由hpv6型、11型、16型、18型、31型、33型、35型、39型、45型、51型、52型、56型、58型及59型中的一种或多种的l1蛋白和/或l2蛋白组装而成的hpv病毒样颗粒。
24、本发明中的hpv抗原可以利用任何的现有技术来制备。制备的hpv抗原可以进一步与铝佐剂混合，制得本发明中的第一组分。
25、在ncbi数据库中，已有许多现有的hpv各型l1蛋白(hpv 6l1、11l1、16l1、18l1、31l1、33l1、45l1、52l1及58l1)序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。在本发明的一些实施方式中，采用了具有高度的保守性的序列，具体情况如下：hpv 6l1的氨基酸序列已于1995年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa74218；hpv 11l1的氨基酸序列已于1994年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa46935；hpv 16l1的氨基酸序列已于1998年在ncbi数据库中收录，登录号为aac09292.1；hpv 18l1蛋白的氨基酸序列已于2003年在ncbi数据库中收录，登录号为aaq92369.1；hpv 31l1蛋白的氨基酸序列已于1994年在ncbi数据库中收录，登录号为aaa46956；hpv 33l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为acl12333.1；hpv 45l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为abp99831.1(截短了n端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响l1蛋白形成vlp，故而截短)；hpv52 l1蛋白的氨基酸序列已于2005年在ncbi数据库中收录，登录号为caa52590.1(截短了n端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响l1蛋白形成vlp，故而截短)；hpv 58l1蛋白的氨基酸序列已于2009年在ncbi数据库中收录，登录号为cax48979.1。需要说明的是，本发明中的抗原并不限于具有上述氨基酸序列的l1蛋白，可以是具有免疫原性的其它l1蛋白，包括已上市疫苗所采用的l1蛋白。
26、在优选的实施方式中，本发明的第一组分还可以是市售的hpv疫苗成品制剂，例如，默沙东公司的四价人乳头瘤病毒疫苗(酿酒酵母)-佳达修(gardasil)和九价人乳头瘤病毒疫苗(酿酒酵母)-佳达修9(gardasil 9)，gsk的双价人乳头瘤病毒吸附疫苗-希瑞适(cervarix)、厦门万泰沧海生物技术有限公司的双价人乳头瘤病毒疫苗(大肠杆菌)-馨可宁(cecolin)、玉溪泽润生物技术有限公司的双价人乳头瘤病毒疫苗(毕赤酵母)-沃泽惠等。
27、在一些实施方式中，所述第一组分是肝炎疫苗成品制剂，例如市售的甲型肝炎灭活疫苗、重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)或重组乙型肝炎疫苗(cho细胞)。
28、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是甲肝病毒抗原。将甲型肝炎病毒(目前一般采取hm175病毒株)接种人二倍体细胞，经培养、收获病毒，再经超滤、离子交换层析及分级离心等方法纯化病毒，最后甲醛灭活处理病毒。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝盐佐剂的情况下，第一组分中的甲型肝炎灭活病毒优选地被吸附(更优选地完全吸附)在该盐上，优选被吸附在氢氧化铝佐剂上。
29、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是乙肝表面抗原。乙型肝炎病毒(hbv)结构由外壳和核心组成，外壳所含的乙肝表面抗原(hbsag)又包含s抗原，pre s1和pre s2抗原，作为病毒识别和侵入宿主细胞的主要结合蛋白，乙肝表面抗原是目前hbv疫苗研发针对的主要靶点。所述乙肝表面抗原可以是通过重组酵母(酿酒酵母、汉逊酵母)或重组cho细胞制造的。hbsag不含有病毒遗传物质，不具备感染性和致病性，但保留了免疫原性。基因工程乙肝疫苗通常先构建含有乙肝表面抗原(hbsag)基因重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酿酒酵母、汉逊酵母或cho细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。
30、本文使用的“乙肝表面抗原”或“hbsag”包括任意hbsag抗原或表现出hbv表面抗原性的任何hbsag抗原或其片段，而不是来源于乙型肝炎病人血浆的乙型肝炎表面抗原。由酵母菌或cho细胞表达的基因工程表面抗原通常是一种分子量约为24kda的226个氨基酸的多肽。如需要，本文中所描述的hbsag还可包括全部或部分pre-s序列。本发明范围内的hbsag也可以包括pre s1-pre s2-s多肽或其类似物。本文所说的hbsag也可指突变体，例如申请号pct/gb1991/000444等的专利申请中描述的“逃逸突变体”，特别是其145位以精氨酸取代甘氨酸的hbsag。乙肝表面抗原(hbsag)的制备文献上有较多记载，参见如harford等在develop.biol.standard 54,125页(1983)上的文章、gregg等在biotechnology5,479页(1987)上的文章、ep-a-0,226,846、ep-a-0,299,108和在其中的参考资料。或者也可以按照现行《中国生物制品规程》中《重组(cho细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备、或参考中国专利申请cn201910996063.x中公开的一种大规模培养cho细胞以制备乙型肝炎疫苗的方法等。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝盐佐剂的情况下，第一组分中的乙肝表面抗原优选地被吸附(更优选地完全吸附)在该盐上，优选被吸附在氢氧化铝佐剂上。
31、在一些实施方式中，本发明的第一组分还可以是任何可选的市售乙型肝炎疫苗成品制剂。例如，北京生物制品研究所有限责任公司、深圳康泰生物制品股份有限公司的重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)；华兰生物疫苗股份有限公司、艾美诚信生物制药有限公司的重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)；华北制药金坦生物技术股份有限公司、兰州生物制品研究所有限责任公司、北京亚东生物制药(安国)有限公司、武汉生物制品研究所有限责任公司的重组乙型肝炎疫苗(cho细胞)；glaxosmithkline biologicals sa的重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)：以及
32、在一些实施方式中，所述第一组分是脊髓灰质炎疫苗成品制剂，例如市售的ⅰ型脊髓灰质炎灭活疫苗、ⅱ型脊髓灰质炎灭活疫苗和/或ⅲ型脊髓灰质炎灭活疫苗。灭活脊髓灰质炎病毒(ipv)的量通常是用“du”单位，每1次人用剂量为0.5ml，含有脊髓灰质炎病毒抗原ⅰ型15du、ⅱ型45du、ⅲ型45du，或者每剂量含病毒抗原量应不低于:ⅰ型30du、ⅱ型32du、ⅲ型45du。
33、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是灭活的脊髓灰质炎病毒抗原(ipv)。脊髓灰质炎可以由三种类型的脊髓灰质炎病毒中的一种引起。这三种类型是相似的并且引起相同的症状，但它们的抗原性差异很大，被一种类型病毒感染后不能防止免受其它类型病毒的感染。因此，本发明采用的三种脊髓灰质炎病毒抗原可以来自于ⅰ型脊髓灰质炎病毒(如mahoney毒株)、ⅱ型脊髓灰质炎病毒(如mef-1毒株)和/或ⅲ型脊髓灰质炎病毒(如saukett毒株)。作为这些毒株的替代，还可以使用ⅰ型-ⅲ型的sabin毒株。
34、脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长，优选的培养物是vero细胞系，它是从猴肾中得到的连续细胞系。vero细胞可方便地培养成为微载体。在病毒感染前和感染期间vero细胞的培养可涉及使用来源于牛的材料(例如小牛血清)、和乳球蛋白水解产物(例如由乳球蛋白酶降解得到的产物)。这些来源于牛的材料应从不患有bse或其它tse的来源获取。在病毒生长后可用诸如超滤、渗滤和层析等技术来纯化病毒颗粒。在给予患者之前，必须将脊髓灰质炎病毒灭活，这可以通过在把病毒用于本发明方法之前用甲醛处理而实现。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝盐佐剂的情况下，在配制之前脊髓灰质炎病毒优选不被吸附于任意佐剂上，但在配制之后脊髓灰质炎病毒可变为被吸附在第一组分中的任何铝佐剂上。
35、可选地，市售的脊髓灰质炎疫苗成品制剂例如：北京科兴生物制品有限公司、中国医学科学院医学生物学研究所、北京生物制品研究所有限责任公司的sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗(vero细胞)等。
36、在一些实施方式中，所述第一组分是百日咳疫苗成品制剂，例如市售的吸附无细胞百日咳疫苗。
37、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是百日咳抗原。百日咳博德特氏菌引起百日咳。疫苗中的百日咳抗原是全细胞，采用灭活的百日咳博德特氏菌形式(wp)或者无细胞形式(ap)。对于细胞百日咳抗原的制备有详细记载，例如其能通过热灭活百日咳博德特氏菌的i期培养物而得到。在使用细胞抗原的情况下，还包含以下抗原中的1种、2种或(优选地)3种：(1)脱毒的百日咳毒素(百日咳类毒素或pt)；(2)丝状血细胞凝集素(fha)；(3)百日咳杆菌粘附素(也称为“69千道尔顿外膜蛋白”)。可以从在改良的stainer-scholte液体培养基中生长的百日咳博德特氏菌培养物中分离制备这三种抗原。从发酵肉汤中分离pt和fha(例如通过吸附在羟基磷灰石凝胶上)，通过加热处理和絮凝(例如用氯化钡)从细胞中提取百日咳杆菌粘附素。用连续的色谱和/或沉淀步骤纯化抗原。可以通过疏水层析法、亲和层析法和尺寸排阻层析法纯化pt和fha。可通过离子交换层析法、疏水层析法和尺寸排阻层析法或者通过imac来纯化百日咳杆菌粘附素。
38、本发明可以使用含pt的wp抗原，或者优选地使用含pt的ap抗原。当使用ap抗原时，本发明抗原性物质通常除了pt以外还将包含fha以及任选地百日咳杆菌粘附素。本发明抗原性物质可以任选地包含2型和3型凝集原。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝盐佐剂的情况下，第一组分中的百日咳类毒素优选地被吸附(有时完全被吸附)在该盐上，优选地被吸附在氢氧化铝佐剂上。任何fha也可以被吸附在氢氧化铝佐剂上。任何百日咳杆菌粘附素也可以被吸附在磷酸铝佐剂上。
39、可选地，市售百日咳疫苗成品制剂例如：兰州生物制品研究所有限责任公司的吸附无细胞百日咳疫苗。
40、在一些实施方式中，所述第一组分是白喉疫苗成品制剂，例如市售的吸附白喉疫苗。通常可用国际单位(iu)表示白喉类毒素的量，每1次人用剂量0.5ml，含白喉类毒素效价不低于30iu。
41、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是白喉杆菌抗原。白喉是由白喉棒状杆菌所引起。该生物体表达原噬菌体编码的adp-核糖基化外毒素(白喉毒素)，对该外毒素进行处理(例如用甲醛)而得到不再有毒性但保留抗原性的类毒素并且可以在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。优选的白喉类毒素是通过甲醛处理而制备。使白喉棒状杆菌在可补充牛提取物的生长培养基(如fenton培养基、或者linggoud和fenton培养基)中生长，接着进行甲醛处理、超滤和沉淀，由此获得白喉类毒素。通过包括无菌过滤和/或透析的方法来处理该类毒素物质。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝盐佐剂的情况下，第一组分中的白喉类毒素优选地被吸附(更优选地完全吸附)在该盐上，优选被吸附在氢氧化铝佐剂上。
42、可选地，市售的白喉疫苗成品制剂例如：成都生物制品研究所有限责任公司、兰州生物制品研究所有限责任公司、北京生物制品研究所有限责任公司、武汉生物制品研究所有限责任公司的吸附白喉疫苗等。
43、在一些实施方式中，所述第一组分是破伤风疫苗成品制剂，例如市售的吸附破伤风疫苗。通常可用国际单位(iu)表示破伤风类毒素的量，每1次人用剂量0.5ml，含破伤风类毒素效价不低于40iu。
44、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是破伤风杆菌抗原。破伤风是由破伤风梭菌引起。该生物体表达内肽酶(破伤风毒素)，经处理后得到不再有毒性但保留抗原性并且可以在注射后刺激特异性抗毒素抗体的产生。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理而制造的类毒素。用生长培养基(如来源于牛酪蛋白的latham培养基)培养破伤风梭菌，接着进行甲醛处理、超滤和沉淀，由此可以获得破伤风类毒素。然后通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此物质。在本发明疫苗组合物中的第一组分包含铝佐剂的情况下，第一组分中的破伤风类毒素优选地被吸附(有时被完全吸附)在该铝佐剂上，优选地被吸附在氢氧化铝佐剂上。
45、可选地，市售的破伤风疫苗成品制剂例如：武汉生物制品研究所有限责任公司、成都生物制品研究所有限责任公司、兰州生物制品研究所有限责任公司、成都欧林生物科技股份有限公司、北京生物制品研究所有限责任公司的吸附破伤风疫苗等。
46、在一些实施方式中，所述第一组分还可以选自吸附无细胞百白破联合疫苗、吸附百白破联合疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗的成品制剂。
47、可选地，市售的一些联合疫苗，例如：玉溪沃森生物技术有限公司、兰州生物制品研究所有限责任公司的吸附无细胞百白破联合疫苗；北京民海生物科技有限公司的无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗；武汉生物制品研究所有限责任公司、兰州生物制品研究所有限责任公司的吸附百白破联合疫苗等。
48、在一些实施方式中，所述第一组分中的抗原性物质是流感病毒抗原。
49、可选地，市售的流感病疫苗成品制剂例如：北京科兴生物制品有限公司、长春生物制品研究所有限责任公司、大连雅立峰生物制药有限公司、华兰生物疫苗有限公司、深圳赛诺菲巴斯德生物制品有限公司的三价灭活流感疫苗；北京科兴生物制品有限公司、长春生物制品研究所有限责任公司、国光生物科技股份有限公司、华兰生物疫苗有限公司、江苏金迪克生物技术股份有限公司、上海生物制品研究所有限责任公司、武汉生物制品研究所有限责任公司的四价灭活流感疫苗；长春百克生物科技股份公司的三价减毒活疫苗；中逸安科生物技术股份有限公司的三价亚单位流感疫苗等。
50、在一些实施方式中，所述第一组分是狂犬病疫苗成品制剂，例如市售的冻干形式或液体形式的人用狂犬病疫苗。经过长期的技术改进，目前应用最广泛的包括地鼠肾细胞疫苗、vero细胞疫苗、人二倍体疫苗三种灭活疫苗。
51、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是狂犬病病毒抗原。狂犬病病毒是一种包膜病毒，其含有编码五种结构蛋白的单链rna基因。除非另有说明，任意可获得的狂犬病抗原可以被用于制备本实施方式中所述的第一组分。who批准了数个用于疫苗生产的狂犬病病毒株，包括但不限于：毕特曼-摩尔株(pm)、巴斯德病毒株(pv)、攻毒标准病毒株(cvs)、来自flury鸡胚胎适应(chick embryo-adapted)株的少代鸡胚传代(lep)或者多代鸡胚传代(hep)株、street-alabama-dufferin(sad)病毒的evelyn rokitniki abelseth(era)株和不同的sad变体。这些经批准的病毒株适应于脑组织培养、鸡胚或鸭胚、原代细胞系(例如地鼠肾细胞系)、人二倍体细胞、或者连续细胞系(例如vero细胞系)中。以上病毒株在灭活和纯化后能够用于制造疫苗。在一些实施方案中，灭活纯化的狂犬病病毒(iprv)选自：ctn株、ag株、毕特曼-摩尔(pm)株以及巴斯德病毒(pv)株。例如，在一些实施方案中，iprv在vero细胞或者原代仓鼠肾(phk)细胞中制备。iprv通过繁殖混合至vero细胞或phk细胞中的病毒株而产生。在收集培养介质的上清液后，作为抗原收集、浓缩、灭活、纯化并存储病毒。
52、可选地，市售的狂犬病疫苗成品制剂例如：长春生物制品研究所有限责任公司、辽宁成大生物股份有限公司、宁波荣安生物药业有限公司、辽宁依生生物制药有限公司的冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)；武汉生物制品研究所有限责任公司、辽宁成大生物股份有限公司、大连雅立峰生物制药有限公司的人用狂犬病疫苗(vero细胞)；艾美诚信生物制药有限公司、河南远大生物制药有限公司的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)等。
53、在一些实施方式中，所述第一组分是肺炎疫苗成品制剂，例如市售的13价、23价肺炎球菌多糖疫苗。
54、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是肺炎链球菌抗原。肺炎链球菌引起细菌性脑膜炎，现有的疫苗是基于肺炎球菌荚膜多糖。因此本发明疫苗组合物中的第一组分可以包含至少一种与载体蛋白偶联的肺炎球菌荚膜多糖。第一组分中可以包括来源于一种或多种不同肺炎球菌血清型的荚膜多糖。在包含来源于超过1种血清型的多糖抗原的情况下，这些抗原优选地单独制备，单独结合，然后加以合并。本领域中已知纯化肺炎球菌荚膜多糖的方法，并且早已知道以来源于23种不同血清型的纯化多糖为基础的疫苗。
55、肺炎球菌荚膜多糖通常是选自以下血清型：1、2、3、4、5、6a、6b、7f、8、9n、9v、10a、11a、12f、14、15b、17f、18c、19a、19f、20、22f、23f和/或33f。因此，第一组分通常可包含来源于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23种或更多不同血清型的荚膜多糖。可选地，13价组合物包括来源于血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19(或19a)、19f和23f的荚膜多糖。
56、可选地，市售的肺炎疫苗成品制剂例如：北京民海生物科技有限公司、北京科兴生物制品有限公司、玉溪沃森生物技术有限公司、成都生物制品研究所有限责任公司的23价肺炎球菌多糖疫苗；玉溪沃森生物技术有限公司的13价肺炎球菌多糖结合疫苗等。
57、在一些实施方式中，所述第一组分是脑膜炎疫苗成品制剂，例如市售的a群脑膜炎球菌多糖疫苗、a群c群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、acyw135群脑膜炎球菌多糖疫苗。
58、根据上述实施方式，所述第一组分中的抗原性物质是脑膜炎球菌抗原。这些抗原可来源于脑膜炎奈瑟球菌(血清群a、b、c、w135和/或y中的一种或多种)。在第一组分包含脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖偶联物的情况下，可以存在一种或多于一种的这种偶联物，包括血清群a、c、w135和y中2、3或4种，通常例如是a+c、a+w135、a+y、c+w135、c+y、w135+y、a+c+w135、a+c+y、a+w135+y、a+c+w135+y等。
59、可选地，市售的脑膜炎疫苗成品制剂例如：北京智飞绿竹生物制药有限公司、成都欧林生物科技股份有限公司、玉溪沃森生物技术有限公司的a群c群脑膜炎球菌多糖结合疫苗；玉溪沃森生物技术有限公司、北京智飞绿竹生物制药有限公司、艾美卫信生物药业(浙江)有限公司的acyw135群脑膜炎球菌多糖疫苗；武汉生物制品研究所有限责任公司、兰州生物制品研究所有限责任公司的a群脑膜炎球菌多糖疫苗；康希诺生物股份公司的acyw135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(crm197载体)等。
60、在一些实施方式中，所述抗原性物质的含量在1-100μg之间，优选在5-50μg之间，例如10μg、20μg、30μg或40μg。
61、根据本发明的一些实施方式，第一组分中的抗原性物质是hpv各型l1 vlp蛋白，其含量在1-100μg之间，更优选在5-50μg之间，例如10μg、20μg、30μg或40μg。
62、在一些实施方式中，所述第一组分包含铝佐剂，所述铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和明矾中的至少一种。铝佐剂可以利用任何的现有技术来制备，也可以采用市售的铝佐剂，例如croda的氢氧化铝佐剂alhydrogel。
63、在一些实施方式中，所述铝佐剂的含量在10-1000μg之间，优选在50-800μg之间，更优选在100-600μg之间，例如200μg、300μg、400μg或500μg。
64、在一些实施方式中，所述第一组分是冻干制剂、溶液或混悬液。
65、在一些实施方式中，所述第一组分中的溶液或混悬液的体积为0.2-1.0ml，优选为0.5ml或1.0ml。
66、在本发明中，作为第二组分的水包油乳剂佐剂包含水相、油相和表面活性剂。其中，水相可以为选自磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸-磷酸缓冲液的缓冲溶液。油相包含可代谢油，优选为角鲨烯，并优选进一步包含α-生育酚。表面活性剂包含聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(司盘)、辛苯聚醇-9(曲拉通x-100)或聚乙二醇辛基苯基醚以及卵磷脂中的一种或多种。例如，水包油乳剂佐剂可以包含角鲨烯、司盘85和吐温80，更优选地，水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80。
67、在一些实施方式中，所述水包油乳剂佐剂包含5-15mg角鲨烯、5-15mgα-生育酚和2-10mg吐温80，优选地，所述水包油乳剂佐剂包含10.69mg角鲨烯、11.86mgα-生育酚和4.86mg吐温80。
68、在一些实施方式中，所述水包油乳剂佐剂的体积为0.2-1.0ml，优选为0.5ml。
69、在一些实施方式中，所述水包油乳剂佐剂进一步包含mpl、皂苷、poly i:c和cpg中的一种或多种。
70、本发明另一方面提供一种上述疫苗组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
71、(i)制备包含抗原性物质和铝佐剂的第一组分；
72、(ii)制备包含水包油乳剂佐剂的第二组分；
73、(iii)将所述第一组分与第二组分分别独立包装后组合，制得佐剂赋能的疫苗组合物，
74、其中步骤(i)和(ii)可以以任一顺序进行，包括先后进行、同时进行或分场地进行。
75、根据本发明的实施方式，制备第一组分时，本发明所提供的制备方法为将可选的抗原性物质吸附至铝佐剂上，以保持所述抗原的稳定性和增强其免疫原性。
76、根据本发明的实施方式，制备第二组分的方法包括：首先将角鲨烯和α-生育酚混合作为油相，然后加入作为水相的含有吐温80的磷酸盐缓冲液，通过搅拌进行乳化，最后进行均质得到水包油乳剂佐剂。
77、本发明还提供上述的疫苗组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。
78、本发明第四方面提供一种包含上述疫苗组合物的试剂盒，其包含独立包装的第一组分和第二组分，所述第一组分包含抗原性物质和铝佐剂，所述第二组分包含水包油乳剂佐剂，所述水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80，所述第一组分和第二组分装在小瓶中。
79、本发明第五方面提供一种包含上述疫苗组合物的多室注射器，其包含第一隔室和第二隔室，所述第一隔室装有第一组分，所述第一组分包含抗原性物质和铝佐剂；第二隔室装有第二组分，所述第二组分包含水包油乳剂佐剂，所述水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80。
80、本发明第六方面提供一种利用所述疫苗组合物诱导免疫应答的方法，其将第一组分和第二组分有时间间隔地施用于受试者，包括以下步骤：
81、(i)向受试者施用所述第一组分；
82、(ii)向受试者施用所述第二组分；
83、其中，上述步骤可以以任一顺序进行，所述的时间间隔至少应为1h，例如，该间隔时间为2h。
84、当两个组分的施用间隔较短时，例如在1min之内，优选在30s内，可认为属于同时施用。
85、根据上述实施方式，所述第一组分和第二组分施用于受试者的同一部位，或者所述第一组分和第二组分分别施用于受试者的不同部位。
86、本发明还提供另一种利用所述疫苗组合物诱导免疫应答的方法，其将第一组分和第二组分同时施用于受试者，包括以下步骤：
87、(i)将所述第一组分和所述第二组分混合；
88、(ii)向受试者施用步骤(i)获得的混合物。
89、本发明还提供一种利用所述疫苗组合物改善cd4+t细胞免疫应答和/或改善b记忆细胞应答的方法，包括向受试者有时间间隔地施用所述第一组分和所述第二组分，或者将所述第一组分和所述第二组分混合后施用于受试者。
90、相比于仅含铝佐剂，不含其他额外佐剂的第一组分获得的cd4+t细胞免疫应答，本发明所述“改善的cd4+t细胞免疫应答”是指在给予本发明提供的疫苗组合物之后，在人机体中获得的cd4+t细胞免疫应答高于前者。
91、改善的cd4+t细胞免疫应答可以通过检测产生任何以下细胞因子的细胞数来评价：
92、产生至少两种不同细胞因子(cd40l、il-2、ifnγ、tnfα)的细胞；
93、产生至少cd40l和另一种细胞因子(il-2、tnfα、ifnγ)的细胞；
94、产生至少il-2和另一种细胞因子(cd40l、tnfα、ifnγ)的细胞；
95、产生至少ifnγ和另一种细胞因子(il-2、tnfα、cd40l)的细胞；
96、产生至少tnfα和另一种细胞因子(il-2、cd40l、ifnγ)的细胞。
97、当和给予第一组分相比，在给予疫苗组合物后产生任何以上细胞因子的细胞量较高时，将存在改善的cd4+t细胞免疫应答。通常，上文提及的5种状况中的至少一种、优选两种将被实现。
98、在一些实施方式中，所述疫苗组合物、试剂盒或多室注射器可用于单独免疫或作为序贯免疫加强针使用。
99、相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
100、本发明在包含抗原性物质和铝佐剂的免疫成分的基础上进一步增加了乳剂佐剂，两种组分可以分开施用或共同施用并能基本上达到与传统制剂形式一致甚至更优的协同佐剂效果，可以有效改善免疫应答，快速刺激抗体的产生。
101、相比于使用传统铝佐剂，本发明提供的疫苗组合物可以提高阳转率和保护率，能够更加快速、长效、安全地刺激机体产生高水平的免疫应答，特别是对无免疫应答人群。本发明的疫苗组合物有望减少疫苗接种剂次或剂量，从而缩短接种周期，提高接种完成率。
102、另一方面，本发明的疫苗组合物在制备时不需要将包含抗原性物质和铝佐剂的免疫成分与乳剂佐剂配制为成品制剂，乳剂佐剂和包含抗原性物质及铝佐剂的免疫成分可以独立包装，从而可以避免抗原性物质或/铝佐剂与乳剂佐剂之间的相互影响，铝佐剂可以吸附抗原性物质，起到保护抗原的作用，同时，铝佐剂与抗原性物质形成整体，与乳剂混合时，抗原性物质无论是被铝佐剂吸附或被乳剂携带，均能同时发挥铝佐剂和乳剂的双重佐剂效果，因此，本发明的疫苗组合物可以达到更加高效、更加安全、同时更加稳定的技术效果。
1.一种疫苗组合物，其特征在于，包含独立包装的第一组分和第二组分，所述第一组分为包含抗原性物质的含或不含佐剂的疫苗成品制剂；所述第二组分为包含水包油乳剂佐剂的赋能佐剂，其中，所述水包油乳剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第一组分为减毒活疫苗、灭活疫苗、类毒素疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、基因工程疫苗或核酸疫苗成品制剂。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第一组分中的抗原性物质包含人乳头瘤病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、百日咳杆菌抗原、白喉杆菌抗原、破伤风杆菌抗原、甲型肝炎抗原、乙型肝炎抗原、狂犬病毒抗原、炭疽杆菌抗原、b型流感嗜血杆菌抗原、肺炎链球菌抗原以及脑膜炎球菌抗原中的一种或多种。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第一组分包含铝佐剂，所述铝佐剂选自氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和明矾中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其特征在于，所述铝佐剂的含量在10-1000μg之间，优选在50-800μg之间，更优选在100-600μg之间。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述第一组分是冻干制剂、溶液或混悬液。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其特征在于，所述溶液或混悬液的体积为0.2-1.0ml，优选为0.5ml或1.0ml。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述水包油乳剂佐剂包含5-15mg角鲨烯、5-15mg α-生育酚和2-10mg吐温80，优选地，所述水包油乳剂佐剂包含10.69mg角鲨烯、11.86mg α-生育酚和4.86mg吐温80。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其特征在于，所述水包油乳剂佐剂的体积为0.2-1.0ml，优选为0.5ml。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述水包油乳剂佐剂进一步包含mpl、皂苷、poly i：c和cpg中的一种或多种。
11.一种权利要求1-10中任一项所述疫苗组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
12.权利要求1-10中任一项所述的疫苗组合物在制备用于治疗或预防疾病的药物中的用途。
13.一种包含权利要求1-10中任一项所述疫苗组合物的试剂盒，其特征在于，包含独立包装的第一组分和第二组分，所述第一组分包含抗原性物质和铝佐剂，所述第二组分包含水包油乳剂佐剂，所述水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80，所述第一组分和第二组分装在小瓶中。
14.一种包含权利要求1-10中任一项所述疫苗组合物的多室注射器，其特征在于，包含第一隔室和第二隔室，所述第一隔室装有第一组分，所述第一组分包含抗原性物质和铝佐剂；第二隔室装有第二组分，所述第二组分包含水包油乳剂佐剂，所述水包油乳剂佐剂包含角鲨烯、α-生育酚和吐温80。
