本发明涉及基因检测，具体涉及一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物、试剂盒及系统。
背景技术：
1、muc1(omim 1q22和158340)编码黏蛋白1，是一种广泛分布于远端肾小管的跨膜糖蛋白，具有维持肾小管腔的重要作用。muc1基因的移码突变产生一种异常序列，编码一个新的肽链，堆积在mucl表达的肾小管上皮细胞内。muc1存在一个“数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeats，vntr)”的结构域，一个胞嘧啶脱氧核苷酸插入该结构域而导致基因发生移码突变，产生了新的肽链(muc1-fs)，这种肽链不能折叠成具有正常功能的蛋白质，并在小管上皮细胞中堆积，最终导致肾小管功能障碍及坏死。目前在muc1的vntr区域中检测到四种不同的muc1突变(27dupc、28dupa、26_27insg和23delinsat)。所有这些突变都会导致相同的移码和过早终止，产生新的肽链(muc1fs)。
2、muc1-vntr区域具有gc含量高、重复单元长且拷贝数高的特点，使得sanger测序、ngs等短片段测序方式无法检测该区域突变。目前有研究使用探针延伸结合质谱进行突变检测，但该方法具有技术局限性，较难推广临床引用。pacbio测序具有序列读长较长，gc片段含量偏好性小的特点，理论上能够检测长单元多拷贝的串联重复序列区域。鉴于pacbio的优势特点，本研究拟采用pacbio smrt平台，开发muc1热点突变检测方法。
技术实现思路
1、针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物、试剂盒及系统，以解决现有检测muc1突变类型的试剂盒及方法较少或临床推广较难的问题。
2、为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物，包括如seq id no.1-seq id no.20所示核苷酸序列的引物中的一对或多对。
4、作为一种可实施方式，所述引物的5’端包括5-50nt不同序列的dna条形码。
5、作为一种可实施方式，所述常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的突变类型包括27dupc、28dupa、26_27insg、23delinsat中的至少一种。
6、第二方面，本发明提供一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的试剂盒，包括所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物。
7、作为一种可实施方式，所述试剂盒包括4体积份的5×primestar gxl buffer、1.6体积份的2.5nm的dntp mixture、0.4体积份的primestar gxl dna、1.2体积份的所述引物和无酶水；所述引物中的每条引物体积占比相同；
8、或，还包括2.5体积份的带barcode的接头、1体积份的10×t4 dna连接酶缓冲液、0.6体积份的atp溶液、0.4体积份的dntp、0.25体积份的t4多核苷酸激酶、0.25体积份的t4dna聚合酶和0.3体积份的t4 dna连接酶。
9、第三方面，本发明提供一种检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的系统，包括样本采集模块、扩增模块、文库制备模块、测序统计模块和判定模块；
10、所述样本采集模块，用于采集待检者的基因组dna样本；
11、所述扩增模块，用于采用所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物或所述的试剂盒对所述基因组dna样本进行高gc pcr扩增；
12、所述文库制备模块，用于将所述高gc pcr扩增后的产物进行纯化和接头连接制得三代测序文库；
13、所述测序统计模块，用于将所述三代测序文库进行三代测序，得测序原始数据；并将所述测序原始数据比对至参考基因组hg19的相应位置；通过muc1的参考区域对bam中的reads进行过滤；再采用vntr区域两端的保守序列对过滤后的reads进行局部比对和剪切，得vntr区；在所述vntr区对突变类型进行判断；对每条reads的vntr区计算拷贝数、突变类型及数量，采用二项分布进行统计；
14、所述判定模块，用于根据统计的结果，得出变异频率最高的拷贝位置，根据变异频率最高的拷贝位置确定muc1变异的突变类型。
15、作为一种可实施方式，所述高gc pcr扩增的扩增条件为94℃、30s；98℃、10s，68℃、10min，循坏30次；4℃保持；
16、其中，接头连接体系包含经纯化的扩增产物、接头、10×t4 dna连接酶缓冲液、atp溶液、dntp、t4多核苷酸激酶、t4 dna聚合酶、t4 dna连接酶和无酶水。
17、其中，接头连接的反应条件为37℃、20min；25℃、15min；65℃、10min；反应完成后再加入exonuclease iii和exonuclease vii，于37℃反应1小时，得三代测序文库。
18、第四方面，本发明提供一种检测muc1基因变异的非疾病诊断目的的方法，包括：
19、采集基因组dna样本；
20、采用所述的引物或所述的试剂盒对所述基因组dna样本进行高gc pcr扩增；
21、将所述高gc pcr扩增后的产物进行纯化和接头连接得测序文库；
22、将所述测序文库进行三代测序，得测序原始数据；并将所述测序原始数据比对至参考基因组hg19的相应位置；通过muc1的参考区域对bam中的reads进行过滤；再采用vntr区域两端的保守序列对过滤后的reads进行局部比对和剪切，得vntr区；在所述vntr区对突变类型进行判断；对每条reads的vntr区计算拷贝数、突变类型及数量，采用二项分布进行统计；
23、根据统计的结果，得出变异频率最高的拷贝位置，根据变异频率最高的拷贝位置确定muc1变异的突变类型。
24、第五方面，本发明提供所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物或所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的试剂盒在制备肾病检测试剂中的应用。
25、本发明的有益效果在于：
26、可以检测二代无法检测的突变：由于muc1的vntr区域具有以60bp为单位的高gc重复的特点，致使muc1突变的研究进展缓慢，本发明通过特异性扩增出vntr区域，进而通过长片段测序，不仅能够准确判定muc1各等位基因上vntr区域的60bp的拷贝数，还能精确判定vnatr区域的插入、缺失等突变；
27、高通量检测：三代测序可实现384种barcode接头，实际还可以根据需要设计更多种barcode接头。或者利用引物带barcode和接头带barcode的双barcode系统实现更多种barcode组合。三代测序平台的高通量特性决定可以实现高通量样品检测；
28、精确度高：pacbio的哑铃状文库在测序时可进行多轮解读，矫正后测序结果碱基精确度大于99％。而且pacbio测序错误是随机的，再通过测序深度矫正碱基精确度大于99.9％。因此可以精确解读引物检测范围内的基因突变；
29、定型准确：通过二项分布进行结果统计，得出变异频率最高的拷贝位置，根据变异频率最高的拷贝位置确定muc1变异的突变类型，可以准确确定muc1变异及位置。
1.一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物，其特征在于，包括如seq id no.1-seq id no.20所示核苷酸序列的引物中的一对或多对。
2.根据权利要求1所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物，其特征在于，所述引物的5’端包括5-50nt不同序列的dna条形码。
3.根据权利要求1所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物，其特征在于，所述常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的突变类型包括27dupc、28dupa、26_27insg、23delinsat中的至少一种。
4.一种用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物。
5.根据权利要求4所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的试剂盒，其特征在于，包括4体积份的5×primestar gxl buffer、1.6体积份的2.5nm的dntpmixture、0.4体积份的primestar gxl dna、1.2体积份的所述引物和无酶水；所述引物中的每条引物体积占比相同；
6.一种检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的系统，其特征在于，包括样本采集模块、扩增模块、文库制备模块、测序统计模块和判定模块；
7.根据权利要求6所述的检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的系统，其特征在于，所述高gc pcr扩增的扩增条件为94℃、30s；98℃、10s，68℃、10min，循坏30次；4℃保持；
8.一种检测muc1基因变异的非疾病诊断目的的方法，其特征在于，包括：
9.权利要求1-3任一所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的引物在制备肾病检测试剂中的应用。
10.权利要求4或5所述的用于检测常染色体显性小管间质性肾病相关基因muc1变异的试剂盒在制备肾病检测试剂中的应用。
