本发明涉及材料化学以及食品生物，公开了一种获得具有高转糖苷活性的固定化β-半乳糖苷酶制备方法及应用。
背景技术：
1、低聚半乳糖（gos）作为一种功能性低聚糖，能够促进人体消化吸收，维持肠道菌群平衡，增强免疫力。β-半乳糖苷酶是一种专门用于将乳糖水解成单糖（包括葡萄糖和半乳糖）的酶，广泛存在于微生物、动植物等中，能够特异性催化乳糖末端非还原性β-d-半乳糖苷单元和糖苷配基之间的糖苷键水解，达到催化gos合成的目的。尽管目前游离β-半乳糖苷酶酶法催化合成gos已在工业中应用，然而，工业化过程中依然存在以下瓶颈问题：（1）游离酶用量大，稳定性不高，不可回收，成本高；（2）gos产率低仍是生物催化法制备低聚半乳糖工业化生产的短板，针对β-半乳糖苷酶介导的酶法合成路线，低聚半乳糖收率通常在20％～45％（对应于40％～60％的底物乳糖转化率），而通过生物催化剂或过程工程技术优化大幅提高低聚半乳糖产率的尝试还未见成功的案例；（3）去除酶法合成路线最终转化液中未反应的乳糖和水解后未被聚合的单糖（葡萄糖和半乳糖）成为低聚半乳糖分离纯化研究的主要难点和瓶颈。目前，国内市场大多数国产低聚半乳糖产品的质量分数低于57％。针对以上问题，本发明旨在构建一种基于固定化材料及方法的新型固定化策略，获得稳定性高、水解活性及转糖苷活性同时得到激发提升的新型固定化β-半乳糖苷酶。
2、静电纺丝纳米纤维技术可以使酶固定化，提高酶对各种变性力的稳定性，大大提高负载酶的催化能力、成本效益，最重要的是提高酶的可重用性（g. bayramoglu, o.celikbicak, m. kilic, m.y. arica, immobilization of candida rugosa lipase onmagnetic chitosan beads and application in flavor esters synthesis, foodchem., 366(2022), 130699.）。静电纺丝技术已在多种酶的固定化中应用，常用的聚合物有纤维素、壳聚糖、海藻酸盐、二氧化硅等（a.l.p. guardado, s. druon-bocquet, m.p.belleville, j. sanchez-marcano, a novel process for the covalentimmobilization of laccases on silica gel and its application for theelimination of pharmaceutical micropollutants, environ. sci. pollut. res., 28(2021), 25579-25593.）。然而，这些传统载体具有一些缺点，例如酶负载能力低、酶活性位点和底物之间存在空间位阻。纳米材料经常用于通过改进关键来固定酶确定纳米生物催化剂效率的因素，特别是改善的酶负荷、大比表面积、降低传质阻力和增加迁移率。其中，石墨烯由于其独特的单六方蜂窝晶格碳原子排列结构，以及其较大的比表面积和较强的范德华力，具有优异的力学性能、导电导热性和抗渗透性。但静电纺丝以及石墨烯与β-半乳糖苷酶催化结合研究上，国内外尚未研究。
技术实现思路
1、针对目前β-半乳糖苷酶稳定性差、不可重复利用、转糖苷活性不高等问题，本发明提供一种新型固定化β-半乳糖苷酶，有更强的稳定性，更好的循环性能，更突出的转糖苷活性，有利于乳糖的水解及gos的生成。
2、为实现目的，本发明采用如下技术方案。
3、一种用于β-半乳糖苷酶固定化的纤维膜，包括功能性氧化石墨烯的合成和聚苯乙烯纳米纤维膜的制备；所述功能性氧化石墨烯的合成方法为烷硅化工艺；所述聚苯乙烯纳米纤维膜的制备方法采用静电纺丝技术。包括以下步骤：（1）连续搅拌将含有3-7%（w/v）3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）的水溶液与醋酸调节至ph3.0-5.0，使其在室温下水解5-20min后加入0.5-2% (w/v) 氧化石墨烯，超声处理5-20 min。之后，将混合物在50-80 °c下连续搅拌0.5-2小时，离心除去硅烷残留物和其他杂质，得到沉淀go-aptes，并用乙醇和水洗涤数次，烘干即可制得功能性氧化石墨烯。（2）将0.3-2.0%（w/v）go-aptes溶解在10-50%（w/v）聚苯乙烯（ps）中，搅拌过夜，制备聚合物载体ps/go-aptes enms。将ps/go-aptes纳米复合溶液填充到注射器进行静电纺丝，电压在10–50 kv，温度20-50 °c。
4、上述步骤（1）优选的，所述的烷硅化工艺过程中使用的试剂为95%乙醇（v/v），5%（w/v）3-氨丙基三乙氧基硅烷，醋酸和氧化石墨烯。
5、上述步骤（1）优选的，氧化石墨烯引入反应混合物中，超声处理时间为10 min，反应条件为：70 °c下连续搅拌2 h。
6、上述步骤（1）优选的，将混合物离心（6000 rpm，10 min），除去硅烷残留物和其他杂质。得到go-aptes，用乙醇和水洗涤数次，并在80 °c下干燥12小时。
7、上述步骤（2）优选地，所述的聚苯乙烯纳米纤维膜的制备过程中，将0.5%（w/v）go-aptes掺入溶解在n，n-二甲基甲酰胺中的20%和35%（w/v）聚苯乙烯（ps）中，然后在使用前将混合物在50 °c下搅拌过夜，制备聚合物载体ps/go-aptes enms。
8、上述步骤（2）优选的，将ps/go-aptes纳米复合溶液填充到注射器（容量：5 ml，针尖内径为1.19 mm）中，流速为2.5 ml/h，静电纺丝的电压约为20-30 kv。将ps/go-aptesenm浇铸到距针尖约17 cm的金属表面收集器上。将所得的enm从收集器表面分离，并在室温下储存以备进一步使用。在静电纺丝过程中，温度为37 °c。
9、本技术提供利用上述纤维素膜固定化β-半乳糖苷酶的制备方法。
10、可选的，本技术提供利用上述纤维素膜固定化β-半乳糖苷酶，具体步骤如下：
11、将制备的ps/go-aptes enm在0-10 °c下浸泡在β-半乳糖苷酶（0-9 mg/ml）的乙酸钠缓冲溶液（ph3-6）中过夜，用水彻底冲洗enms，除去游离β-半乳糖苷酶，得到固定化β-半乳糖苷酶。
12、本技术提供上述固定化β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖制备中的应用。
13、可选的，本技术提供上述固定化β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖制备中的应用，具体步骤如下：
14、在50-70 °c下将乳糖溶于醋酸钠缓冲溶液（ph3-6）中，制备最佳初始乳糖浓度（100 -500 g/l）溶液。向乳糖（100 -500 g/l）溶液中加入固定化β-半乳糖苷酶（2-8 mg/ml）。将混合物在30-40 °c下振荡孵育6-12h。
15、上述步骤优选的，乳糖溶液初始ph值4.5，在ph4.5时，酶活力最高。
16、上述步骤优选的，乳糖溶液浓度200 g/l，低于或高于该浓度，固定化酶糖苷酶活力会受到抑制，此浓度下，乳糖转化率最高，低聚半乳糖（gos）得率最高。
17、上述步骤优选的，固定化β-半乳糖苷酶加酶量为：4 mg/ml，低于该浓度，生成gos的速率较慢，高于该浓度，也不能明显提高gos的生成速率。
18、上述步骤优选的，反应温度为37 °c。
19、上述步骤优选的，反应时间为12 h，低于12 h，gos的产量持续增加，高于12 h，gos产量没有明显变化。
20、有益效果
21、1、本发明通过功能性氧化石墨烯对静电纺丝纳米纤维聚苯乙烯进行改性的新策略制备了固定化β-半乳糖苷酶。
22、2、本发明制备的固定化β-半乳糖苷酶表现出高吸附率、储存稳定性和高重复利用度等的优点。
23、3、本发明制备的固定化β-半乳糖苷酶的催化行为发生变化，显提高了乳糖水解能力和转糖苷活性。
24、4、将本发明制备的固定化β-半乳糖苷酶应用于益生元低聚半乳糖（gos），得到迄今为止的最高产量，为141 g/l，得率72%，而游离β-半乳糖苷酶得率为50%。乳糖转化率达82%，而游离酶对应转化率为55%。
25、5、本发明反应体系中最终产物gos含量高，已高于国内市场大多数国产低聚半乳糖产品的质量分数，可免去分离纯化过程，直接作为终产品；体系中葡萄糖及半乳糖单糖浓度低，未转化的乳糖浓度低，是获得高纯度gos（90%以上）的良好的原料。
1.一种β-半乳糖苷酶固定的纤维素膜，其特征在于合成功能性氧化石墨烯应用于聚苯乙烯静电纺丝纳米纤维膜的制备。
2.根据权利要求1所述的纤维素膜制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）通过连续搅拌将含有3-7%（w/v）3-氨丙基三乙氧基硅烷（aptes）的水溶液与醋酸调节至ph 3.0-5.0，使其在室温下水解5-20 min后加入0.5-2% (w/v) 氧化石墨烯，超声处理5-20 min。之后，将混合物在50-80 °c下连续搅拌0.5-2小时，离心除去硅烷残留物和其他杂质，得到沉淀go-aptes，并用乙醇和水洗涤数次，烘干即可制得功能性氧化石墨烯。（2）将0.3-2.0% （w/v）go-aptes溶解在10-50%（w/v）聚苯乙烯（ps）中，搅拌过夜，制备聚合物载体ps/go-aptesenms。将ps/go-aptes纳米复合溶液填充到注射器进行静电纺丝，电压在10–50 kv，温度20-50 °c。
3.一种固定化β-半乳糖苷酶的制备方法，其特征在于根据权利要求2所述的纤维素膜制成。
4.根据权利要求3所述的固定化β-半乳糖苷酶，其特征在于，包括以下步骤：将制备的ps/go-aptes enm在0-10 °c下浸泡在β-半乳糖苷酶（0-9 mg/ml）的乙酸钠缓冲溶液（ph3-6）中过夜，用水彻底冲洗enms，除去游离β-半乳糖苷酶，此时β-半乳糖苷酶吸附收率高最高，酶活高。
5.根据权利要求3所述的固定化酶在低聚半乳糖（gos）制备中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：向乳糖（100-500 g/l）溶液中加入固定化β-半乳糖苷酶（2-8 mg/ml）。将混合物在30-40 °c下振荡孵育6-12 h。乳糖转化率最高，低聚半乳糖（gos）得率最高。
7.根据权利要求6所述的应用，重复使用固定化β-半乳糖苷酶，重复使用性能良好。
