本发明属于分析化学领域，具体涉及一种基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素定量分析方法。
背景技术：
1、叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素，对油菜的生长发育有着不可替代的作用，其中油菜籽中叶绿素的含量是油菜籽的分级参考指标。当前，叶绿素的传统测定分析方法主要包括紫外分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法等，然而这些检测方法依赖于大型仪器，检测成本较高且费时，不能实现低成本的现场快速检测。
2、在众多的分析方法中，薄层色谱法和纸色谱法等具有省时简便、成本低、操作简单等优点，但基本上主要适用于食品的快速定性分析或半定量分析，很少被用于定量分析，比如对中药中的黄芪、车前子、桂枝等物质进行定性鉴别，以及分离食用油中的甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯、脂肪酸等油脂混合物。而且，目前薄层色谱法的结果多使用薄层扫描仪和专业图像处理软件进行检测，设备成本高且费时。
3、因此，亟需一种操作简便、快速准确的叶绿素定量分析方法，对快速鉴定油菜籽品质具有重要的意义。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供一种基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素定量分析方法，可以对油菜叶片和油菜籽等样品中的叶绿素通过薄层色谱分析实现快速检测和定量。
2、本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
3、基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，包括如下步骤：
4、步骤一：配制不同浓度的叶绿素标准溶液，然后通过薄层色谱板进行分离，获得不同浓度的叶绿素标准溶液在紫外光照射下的色谱斑点；将待测样品溶液通过薄层色谱板进行分离，获得待测样品溶液在紫外光照射下的色谱斑点；
5、步骤二：采用薄层色谱定量分析系统拍摄步骤一所得色谱斑点的图片(包括叶绿素标准溶液在紫外光下的色谱斑点和待测样品溶液在紫外光下的色谱斑点)或者导入步骤一所得色谱斑点的图片，对色谱斑点的图片进行图像预处理后，圈选色谱斑点生成候选框，通过移动和缩放修正候选框的位置和尺寸使其贴合色谱斑点区域，识别并保存色谱斑点面积；
6、步骤三：在薄层色谱定量分析系统中，根据叶绿素标准溶液的浓度及其在步骤二所得的色谱斑点面积，拟合色谱斑点面积和浓度的标准曲线；并利用薄层色谱定量分析系统的结果查询模块，将待测样品溶液在紫外光下的色谱斑点面积代入标准曲线，得到待测样品溶液中叶绿素的浓度。
7、按上述溶液，叶绿素标准溶液采用叶绿素标准品溶解在溶剂无水乙醇中配制所得，浓度范围一般在0～1.00mg/ml范围内。
8、按上述方案，步骤一中，薄层色谱板进行分离时，采用的展开剂为石油醚(沸程60～90℃)、丙酮和甲苯的混合溶剂，石油醚、丙酮和甲苯的体积比为2∶(1～2)∶(1.5～2.5)，最优选2∶1.5∶2；采用的层析板为硅胶层析板，点样量为1.5～2.5μl为宜；照射所用的紫外光波长为360～370nm为宜。
9、按上述方案，待测样品为油菜籽、油菜叶等，经粉碎、研磨、溶剂提取叶绿素后，得到待测样品的叶绿素提取液；当油菜叶为待测样品时，叶绿素提取液可以直接作为待测样品溶液；当油菜籽为待测样品时，叶绿素提取液还需要氮气吹干后，无水乙醇复溶，才能得到待测样品溶液。进一步具体地，当油菜籽作为待测样品时，待测样品溶液的制备过程如下：准确称取一定量的未成熟或未完全成熟的油菜籽，除杂后置于密封袋中混匀碾碎，然后转移至离心管中，并加入钢珠和乙醇，用研磨仪50～80hz研磨1～3min；随后用少量乙醇进行溶解，涡旋均匀后离心取上清液，即待测样品的叶绿素提取液；将该提取液氮气吹干后，用无水乙醇复溶，即得到待测样品溶液。当油菜叶片作为待测样品时，待测样品溶液的制备过程如下：准确称取一定量油菜叶片，加入适量的碳酸钙和石英砂，采用无水乙醇研磨提取的方法，将提取液过滤后用无水乙醇定容，即为待测样品溶液。
10、按上述方案，所述薄层色谱定量分析系统主要包括注册登录模块、图片处理模块、线性拟合模块和结果查询模块；其中，所述注册登录模块用于实现用户注册和登录系统；所述图片处理模块用于实现从相册导入图片或者打开相机拍摄图片，对图片进行预处理，以及对图片中色谱斑点进行圈选修正，识别并保存色谱斑点面积；所述线性拟合模块用于拟合叶绿素标准溶液的浓度和色谱斑点面积之间的标准曲线；所述结果查询模块依据标准曲线和待测样品溶液在紫外光下的色谱斑点面积计算待测样品溶液中叶绿素的浓度，并显示结果(即待测样品溶液中叶绿素的浓度)。
11、进一步地，所述图片处理模块中，图片预处理包括图片空间变换、自动压缩和自动裁剪等操作，其中；图片空间变换和自动压缩时，将图片从bgr通道转化到rgb通道，并根据图片内存大小不同进行不同大小倍数压缩，内存越大，压缩倍数越大，使得最终图片内存大小<1mb；由于图片包含色谱斑点的周围环境信息，且周围环境信息与色谱斑点区域明亮度也存在差异，所以对图片自动裁剪，只保存和显示色谱斑点区域。
12、进一步地，所述图片处理模块中，色谱斑点面积通过opencv函数自动识别计算获得，并通过sqlite数据库保存。具体地，手动圈选图片中色谱斑点区域，并自动识别生成椭圆候选框，通过移动和缩放修正椭圆候选框的位置和尺寸，使其与所述色谱斑点区域相贴合，并将所有椭圆候选框按照一定的顺序进行编号，然后通过opencv函数识别修正后的椭圆框面积即色谱斑点面积，将色谱斑点面积通过悬浮窗进行显示并保存在sqlite数据库中。另外，保存色谱斑点面积时同时保存对应的椭圆候选框编号(即对应的图像编号)。
13、更进一步地，所述薄层色谱定量分析系统还包括搜索模块，用于实现对已保存斑点面积进行查询以及删除操作。
14、进一步地，所述线性拟合模块中，标准曲线是通过对叶绿素标准溶液的浓度及其在步骤二所得的色谱斑点面积建立散点图，并根据散点图自动拟合曲线，生成标准曲线以及相关系数r2。其中，散点图数据可以单个点逐个添加，同时可以通过数据库直接全部添加。
15、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
16、现有技术中的薄层色谱法很少被用于定量分析，大多数是用于定性分析或半定量分析，目前也没有文献报道采用薄层色谱法对叶绿素进行定量分析检测，而本发明提供了一种基于薄层色谱的叶绿素定量分析方法，通过采用特定的展开剂等薄层色谱分离条件，建立了叶绿素斑点面积和相应的浓度之间存在的定量关系，实现了叶绿素的快速检测；而且，采用基于智能手机的薄层色谱定量分析系统，无需使用其他数据统计分析软件，方便快捷。
1.基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，叶绿素标准溶液采用叶绿素标品溶解在溶剂无水乙醇中配制所得，浓度范围在0～1.00mg/ml范围内。
3.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，步骤一中，薄层色谱板进行分离时，采用的展开剂为石油醚、丙酮和甲苯的混合溶剂，石油醚、丙酮和甲苯的体积比为2∶(1～2)∶(1.5～2.5)；采用的层析板为硅胶层析板，点样量为1.5～2.5μl；照射所用的紫外光波长为360～370nm。
4.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，待测样品为油菜籽或油菜叶，经粉碎、研磨、乙醇提取叶绿素后，得到待测样品溶液的叶绿素提取液；以叶绿素提取液作为待测样品溶液，或者叶绿素提取液经氮气吹干和无水乙醇复溶后作为待测样品溶液。
5.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，所述薄层色谱定量分析系统主要包括注册登录模块、图片处理模块、线性拟合模块和结果查询模块；其中，所述注册登录模块用于实现用户注册和登录系统；所述图片处理模块用于实现从相册导入图片或者打开相机拍摄图片，对图片进行预处理，以及对图片中色谱斑点进行圈选修正，识别并保存色谱斑点面积；所述线性拟合模块用于拟合叶绿素标准溶液的浓度和色谱斑点面积之间的标准曲线；所述结果查询模块依据标准曲线和待测样品溶液在紫外光下的色谱斑点面积计算待测样品溶液中叶绿素的浓度，并显示结果，即待测样品溶液中叶绿素的浓度。
6.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，所述图片处理模块中，图片预处理包括图片空间变换、自动压缩和自动裁剪的操作，将图片从bgr通道转化到rgb通道，并根据图片内存大小不同进行不同大小倍数压缩，使图片内存大小<1mb，并对图片自动裁剪，只保存和显示色谱斑点区域。
7.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，所述图片处理模块中，手动圈选图片中色谱斑点区域，并自动识别生成椭圆候选框，通过缩放和平移修正椭圆候选框的位置和尺寸，使其与所述色谱斑点区域相贴合，并将所有椭圆候选框按照一定的顺序进行编号，然后通过opencv函数识别修正后的椭圆框面积即色谱斑点面积，将色谱斑点面积通过悬浮窗进行显示并保存在sqlite数据库中；保存色谱斑点面积时同时保存对应的图像编号。
8.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，所述薄层色谱定量分析系统还包括搜索模块，用于实现对已保存斑点面积进行查询以及删除操作。
9.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，所述线性拟合模块中，标准曲线是通过对叶绿素标准溶液的浓度及其在步骤二所得的色谱斑点面积建立散点图，并根据散点图自动拟合曲线，生成标准曲线。
10.根据权利要求1所述的基于薄层色谱定量分析系统的叶绿素的定量分析方法，其特征在于，叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b，叶绿素a的标准曲线为ya＝2239.7xa+2042.4，其中ya为叶绿素a的色谱斑点面积，xa为叶绿素a的标准溶液浓度；叶绿素b的标准曲线为yb＝1475.3xb+1160.1，其中yb为叶绿素b的色谱斑点面积，xb为叶绿素b的标准溶液浓度。
