本发明属于生物检测，尤其涉及一种四环素sers检测系统及其检测方法和应用。
背景技术：
1、四环素(tc)是一类具有菲烷母核的广谱抗生素，其通过与细菌胞内核糖体30s亚基形成可逆结合体或结合线粒体70s亚基从而抑制蛋白质合成从而抑制细菌的生长，因其对革兰氏阳性菌、格兰仕阴性菌优秀的耐菌能力以及其廉价的制备成本而被广泛应用于农业、畜牧业等多种行业。近年来由于抗生素的滥用导致细菌耐药性加剧的案例已被广泛报道，四环素类抗生素在环境中的残留主要表现在土壤环境、水环境、肉类、乳制品、鸡蛋等食品中，过度使用的tc不可避免的经过动植物食品的累计最终到达食物链顶端人类体中，而过量tc的摄入会破坏人肠道微生物群平衡，导致胃肠道疾病，同时还会增加哮喘、过敏等疾病的患病风险。
2、目前四环素类抗生素残留的检测方法主要有高效液相色谱、色谱/质谱联用技术、酶联免疫分析等，其中色谱分析法仪器设备贵重，样品前处理复杂，需专业人员操作；液质联用法具有优秀的准确度，然而环境及食品中层层传递下的tc的残留量不足以使其达到灵敏检测的要求；而酶联免疫分析方法相对复杂，灵敏度较低，成本较高，且均需要复杂的样品前处理。因此，亟需发明一种检测方法简单、灵敏度高的检测四环素类抗生素方法。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种四环素sers检测系统及其检测方法和应用，从而实现四环素的快速、灵敏高、特异性强的检测。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
3、本发明提供了一种四环素sers的检测系统，包括：多刺突病毒状等离子体金sers探针、ap·s1和s0修饰的磁性微球和s4修饰的金基底；所述多刺突病毒状等离子体金sers探针的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述ap的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述s1的核苷酸序列如seq idno.2所示；所述s0的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述s4的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4、优选的，所述多刺突病毒状等离子体金sers探针的制备方法包括：将s5、s6、tcep与多刺突病毒状等离子体金混合，然后进行老化，离心后得到的沉淀为所述多刺突病毒状等离子体金sers探针；所述s5的核苷酸序列为5’-rox-ttacgtt-sh-3’，所述s6的核苷酸序列如seq id no.5所示。
5、优选的，所述多刺突病毒状等离子体金的制备方法包括：将经过柠檬酸钠还原法得到的金种子颗粒分散到ctab水溶液中，于75～85℃条件下保温25～35min，加入柠檬酸钠水溶液，保温15～25min后，滴加氯金酸水溶液，持续8～12min，保温25～35min，共滴加3次，冷却洗涤得到所述多刺突病毒状等离子体金。
6、更优选的，所述ctab水溶液的浓度为15～17g/l。
7、优选的，所述ap·s1和s0修饰的磁性微球的制备方法包括：将ap和s1于90～100℃环境中3～8min后，得到ap·s1；将ap·s1、s0和edc/nhs溶液混合，在20～30℃下反应2.5～3.5h，加入表面氨基功能化的磁性微球，20～30℃条件下搅拌3～5h后，得到所述ap·s1修饰的磁性微球和s0修饰的磁性微球；所述表面氨基功能化的磁性微球中引入的官能团为氨基。
8、优选的，所述s4修饰的金基底的制备方法包括：将s4与tcep混合后，与聚二甲基硅氧烷薄膜在35～40℃条件下混合一夜后，在氯化钠和乙酸乙酸钠缓冲体系中老化10～15h，得到s4修饰的金基底。
9、本发明还提供了一种利用上述检测系统对四环素的检测方法，包括：将ap·s1和s0修饰的磁性微球、不同浓度四环素标准溶液和剪切酶反应，用磁力架进行分离，获得含有s3的dna溶液；将所述dna溶液、聚合酶和多刺突病毒状等离子体金sers探针在s4修饰的金基底上反应；检测反应后金基底的表面增强拉曼谱图，用表面增强拉曼谱图中1499cm-1特征峰与四环素浓度构建线性模型；根据线性模型对待测样品中的四环素进行定量分析检测；所述s3的序列如seq id no.3所示。
10、优选的，获得所述含有s3的dna溶液的反应温度为35～40℃，时间为35～45min。
11、优选的，金基底上反应的温度为37℃，时间为35～45min。
12、本发明还提供了上述四环素sers检测系统在检测食品或环境中四环素中的应用。
13、相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
14、本发明以表面增强拉曼光谱法(sers)为基础，通过制备的高活性等离子多刺突类病毒金sers探针，并结合双机级联步行器扩增介导的探针工程化组装策略，有效实现了靶信号的扩增，合理设计的模块化运行模式和分子识别机制使得该传感策略具有极低的背景信号，极大地提高检测灵敏度降低其检出限，降低了背景干扰。通过四环素适体(高活性等离子多刺突类病毒金sers探针，能特异性识别四环素，增强信号)实现了传感器的高特异性识别，同时定制的双机联动dna步进器电路处理器单元使得该方案具有极高的专一性。
15、本发明通过双机联动dna步行器电路，大量的多刺突病毒状等离子体金被组装到金基底表面，这使得其形成全域等离子耦合热点，具有更强大的电磁域增强面积和更强的近场聚焦能力。这种双机级联步行器扩增介导的探针工程化组装策略使检测系统能够获得更高的sers分析信号。
16、本发明所述多刺突病毒状等离子体金具有优秀的比表面积及强大表面等离子体共振，从而具有优秀的sers增强能力，将拉曼输出信号提高了几个数量级。
17、本发明使用的表面增强拉曼光谱法(sers)是用拉曼光谱法检测吸附在金、银、铜等粗糙金属表面的样品的方法，既继承了拉曼光谱法丰富的指纹信息，又可以使拉曼信号进行百万倍的放大。与传统的生物分析方法相比，sers在生物分析方面具有如下几个优势：(1)sers具有超高的表面敏感性，甚至低至单分子水平；(2)sers信号可以反映生物系统的内在分子指纹信息；(3)与荧光分光光度法等其他方法相比，sers对光漂白和光降解具有抗性，适合长期监测；(4)sers峰的带宽通常非常窄，比有机染料或量子点的荧光发射窄10-100倍；(5)sers能够方便地进行单波长激发的多重监测；(6)sers纳米生物探针可以设计成不同的尺寸、形状和涂层以适用于不同的检测目的。
1.一种四环素sers的检测系统，其特征在于，包括：多刺突病毒状等离子体金sers探针、ap·s1和s0修饰的磁性微球和s4修饰的金基底；
2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述多刺突病毒状等离子体金sers探针的制备方法包括：将s5、s6、tcep与多刺突病毒状等离子体金混合，然后进行老化，离心后得到的沉淀为所述多刺突病毒状等离子体金sers探针；所述s5的核苷酸序列为5’-rox-ttacgtt-sh-3’，所述s6的核苷酸序列如seq id no.5所示。
3.根据权利要求2所述的检测系统，其特征在于，所述多刺突病毒状等离子体金的制备方法包括：将经过柠檬酸钠还原法得到的金种子颗粒分散到ctab水溶液中，于75～85℃条件下保温25～35min，加入柠檬酸钠水溶液，保温15～25min后，滴加氯金酸水溶液，持续8～12min，保温25～35min，共滴加3次，冷却洗涤得到所述多刺突病毒状等离子体金。
4.根据权利要求3所述的检测系统，其特征在于，所述ctab水溶液的浓度为15～17g/l。
5.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述ap·s1和s0修饰的磁性微球的制备方法包括：将ap和s1于90～100℃环境中3～8min后，得到ap·s1；将ap·s1、s0和edc/nhs溶液混合，在20～30℃下反应2.5～3.5h，加入表面氨基功能化的磁性微球，20～30℃条件下搅拌3～5h后，得到所述ap·s1和s0修饰的磁性微球；所述表面氨基功能化的磁性微球中引入的官能团为氨基。
6.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述s4修饰的金基底的制备方法包括：将s4与tcep混合后，与聚二甲基硅氧烷薄膜在35～40℃条件下混合一夜后，在氯化钠和乙酸乙酸钠缓冲体系中老化10～15h，得到s4修饰的金基底。
7.一种利用权利要求1～6任意一项所述检测系统对四环素的检测方法，其特征在于，包括：将ap·s1和s0修饰的磁性微球、不同浓度四环素标准溶液和剪切酶反应，用磁力架进行分离，获得含有s3的dna溶液；将所述dna溶液、聚合酶和多刺突病毒状等离子体金sers探针在s4修饰的金基底上反应；检测反应后金基底的表面增强拉曼谱图，用表面增强拉曼谱图中1499cm-1特征峰与四环素浓度构建线性模型；根据线性模型对待测样品中的四环素进行定量分析检测；所述s3的序列如seq id no.3所示。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，获得所述含有s3的dna溶液的反应温度为35～40℃，时间为35～45min。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，金基底上反应的温度为37℃，时间为35～45min。
10.权利要求1所述四环素sers检测系统在检测食品或环境中四环素中的应用。
