本发明属于生物，涉及富马酸二甲酯在制备治疗犬伪中间葡萄球菌性角膜炎药物中的应用。
背景技术：
1、犬角膜溃疡是临床常见眼科疾病，该类疾病发病急，病程短，愈后差，是导致犬失明的常见因素。近期流行病学调查结果显示，伪中间葡萄球菌(staphylococcuspseudintermedius，s.pseudintermedius)是继金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌外的第三种介导角膜炎的常见病原菌。s.pseudintermedius可胞内感染犬角膜上皮细胞，并诱导细胞的氧化损伤和细胞焦亡，这是其导致的角膜溃疡治愈率低、病程短的主要因素之一。
2、目前犬伪中间葡萄球菌性角膜炎多采用抗生素进行治疗，但抗生素的广泛使用也是造成病原菌耐药性增加的主要因素之一。近期研究表明，s.pseudintermedius对临床常见眼科用抗生素类药物耐药性增加，亟需全新的药物应用于临床疾病的治疗。
3、富马酸二甲酯(dimethyl fumarate，dmf，144.13g/mol)，属富马酸脂家族，为α，β-不饱和羧酸酯。dmf进入体内后，可被酯酶消化分解成富马酸单甲酯(monomethylfumarate，mmf)，进一步水解成富马酸(fumaric acid，fa)。fa可进入机体三羧酸循环系统，诱导琥珀酸形成和半胱氨酸的失活，影响机体的氧化还原反应。但dmf是否对细菌性眼部感染有治疗效果，未见报道。
技术实现思路
1、本发明提供富马酸二甲酯在制备犬伪中间葡萄球菌性角膜炎药物的应用，本发明检测了dmf在浓度为20μm/l或200μm/l时，对s.pseudintermedius胞内感染ccecs是细胞焦亡率、胞内ros含量、细胞上清液中ldh含量、细胞内外菌数的影响。并通过对od600和od570的检测，探究不同浓度(10，15，20，25，30，40，50，100，200，500和1000μm/l)的dmf对s.pseudintermedius生长和生物被膜形成的影响。
2、为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
3、富马酸二甲酯在制备治疗犬伪中间葡萄球菌性角膜炎药物中的应用，所述犬伪中间葡萄球菌性角膜炎由伪中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)感染导致。
4、进一步的，所述富马酸二甲酯的浓度大于20μm/l。
5、进一步的，所述富马酸二甲酯的浓度大于200μm/l。
6、进一步的，所述富马酸二甲酯用于抑制伪中间葡萄球菌的生长。
7、进一步的，所述富马酸二甲酯用于抑制伪中间葡萄球菌生物被膜的形成。
8、进一步的，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌的细菌生长活力。
9、进一步的，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后细胞上清液中ldh含量。
10、进一步的，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞焦亡率。
11、进一步的，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞内、外细菌数。
12、进一步的，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞内ros含量。
13、进一步的，将ccecs按1×105的数量接种于细胞培养皿，待细胞达80％融合，对照组加基础培养液继续培养，胞内感染组按moi＝1:1加入对数生长期的s.pseudintermedius，培养3h。加入终浓度为100μg/ml和100μg/ml的庆大霉素和溶菌酶，37℃细胞培养箱内孵育20min。弃培养液，pbs清洗3次，分别加入终浓度为50μg/ml和50μg/ml的庆大霉素和溶菌酶，进行维持培养3h。
14、进一步的，将ccecs按1×105的数量接种于细胞培养皿，待细胞达80％融合，弃培养液，pbs清洗3次。添加dmf溶液，使其终浓度分别为20μm/l和200μm/l。
15、进一步的，细胞按每孔1×103个细胞的密度接种到于96孔细胞板，37℃、5％ co2细胞培养箱内培养。待细胞生长至80％以上汇合后，更换基础培养基200μl，加入dmf溶液，使其终浓度分别为10，15，20，25，30，40，50，100，200，500和1000μm/l。每孔加入10μl cck-8，放入细胞培养箱孵育2.5h。酶标仪检测波长450nm处吸光度。
16、进一步的，收集各组培养上清液。参照说明书加入对应试剂，混匀后室温静置5min，用酶标仪在450nm波长测定吸光度值，以定量细胞培养液中ldh含量。
17、进一步的，感染过程中胞内菌计数组，使用pbs清洗3次，加入终浓度为50μg/ml和25μg/ml的庆大霉素和溶菌酶维持培养。细菌胞内感染时间0和3h，弃培养基，使用pbs清洗3次，使用0.2％胰酶-0.02％ edta消化1～2min，加入2倍体积的完全培养液终止消化，1200rpm离心5min，弃上清。加入1ml10％triton-x溶液重悬，取10μl进行细胞计数。剩余溶液置于37℃孵育20min，每5min涡旋振荡一次。离心(4000rpm，5min)，弃上清，加入1ml无菌pbs重悬。将重悬液分别稀释10、100和1000倍。从各稀释液内各取10μl，分别涂布在lb琼脂平板，在37℃有氧环境下培养12h后，对细菌数进行统计。
18、进一步的，感染过程中胞外菌计数组，清除胞外菌后不添加庆大霉素和溶菌酶维持培养。各组处理完成后，其余步骤与“胞内菌计数”方法相同。对细胞上清液进行收集和平板涂布，在37℃有氧环境内培养12h后对菌落数进行统计分析。
19、进一步的，使用不含edta的胰酶消化细胞，离心(1200rpm，5min，4℃)，使用pbs按照稀释比例1:30稀释flica(caspase-1荧光标记探针)，每支样品加入200μl染液，37℃孵育1h，离心(1200rpm，5min，4℃)，pbs重复清洗3次；加入100μl binding buffer将细胞沉淀重悬，加入5μl pi staining solution，避光37℃孵育10min；加入400μl binding buffer，混匀，流式细胞仪检测。流式二维图分析pi/caspase-1双染细胞比例，以pi+/caspase-1+判定为caspase-1介导的细胞焦亡。
20、进一步的，将各组细胞培养上清分别转移到无菌离心管内，使用pbs将培养皿清洗三次，胰酶消化法收集细胞于上述无菌离心管内，离心去上清(1200rpm，5min)。使用1ml含10μm dcfh-da探针的基础培养基将细胞重悬，37℃温箱内孵育40min，每3min颠倒混匀一次。孵育完毕后，离心以去除未装载探针，并使用基础培养基重悬清洗、离心3次以上以去除细胞外的dcfh-da。采用流式细胞仪检测细胞内活性氧含量。
21、有益效果
22、dmf早期是一种防腐剂，可进入微生物三羧酸循环过程，抑制其呼吸作用，进而发挥抗菌效果。dmf可靶向gsdmd蛋白的cys191/cys192位点，限制其聚合作用，抑制细胞焦亡。本试验中将不同浓度的dmf处理细胞，发现其具有抗炎、抗菌效果，是用于临床细菌性角膜炎治疗的新型药物。
23、本发明首次将dmf作为临床细菌性角膜炎治疗的新型药物进行研究，发现并证实了其有效的抗炎抗菌效果。本研究中首次发现，200μm/l的dmf应用后，可有效抑制胞内、胞外细菌数，并表现出优于dmf在浓度为20μm/l时的抗炎效果。200μm/l的dmf应用后，可将s.pseudintermedius胞内感染ccecs过程中，细胞上清液中ldh含量从2434u/l降至354u/l，降低85.5％；将细胞焦亡率从12.511％降至6.6％，降低47.2％；将胞内菌数从2.31cfu/ml降至0.982cfu/ml，降低57.5％；将胞外菌数从2.78×107cfu/ml降至8.3×105cfu/ml，降低97％；将胞内ros相对含量从7.17降至1.26，降低82.4％。本研究中首次发现，dmf以浓度依赖性抑制s.pseudintermedius的生长和生物被膜的形成。本发明的技术方案可为dmf的临床应用奠定基础，可实现临床转化，作为新型药物应用。
1.富马酸二甲酯在制备治疗犬伪中间葡萄球菌性角膜炎药物中的应用，其特征在于，所述犬伪中间葡萄球菌性角膜炎由伪中间葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)感染导致。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯的浓度大于20μm/l。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯的浓度大于200μm/l。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于抑制伪中间葡萄球菌的生长。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于抑制伪中间葡萄球菌生物被膜的形成。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌的细菌生长活力。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后细胞上清液中ldh含量。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞焦亡率。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞内、外细菌数。
10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述富马酸二甲酯用于降低伪中间葡萄球菌感染后的细胞内ros含量。
