本发明属于农产品检测领域，涉及一种果蔬采后品质的研究方法，特别涉及一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法。
背景技术：
1、果蔬采收后仍保留大量的田间热，呼吸旺盛，持续释放大量的呼吸热，导致果蔬加快成熟衰老，品质降低，严重时还会造成腐烂。冷链物流技术是保证果蔬采后新鲜度、提高运输效率、降低采后损耗、保证食品安全、增强竞争力和促进农业产业化发展等方面的重要措施。
2、然而许多果蔬对低温敏感，包括：枇杷、桃、猕猴桃、香蕉、芒果、番茄、黄瓜、茄子、甜瓜、甜椒、西葫芦等(烟小霞,康宁波,鲁玲,et al.果蔬采后冷害及调控技术的研究进展食品与发酵工业[j],2023.49:325-334.)，不适宜的冷链物流环境反而会加速这些果蔬品质的劣变。不同种类不同品种的果蔬对冷害的响应温度和发生时间存在差异，且冷害症状的发生有往往具有一定的滞后性，即在低温贮藏过程果蔬外观没有明显的变化，但在常温货架销售过程快速出现品质的劣变症状。以枇杷果实为例，0℃贮藏易导致冷害的发生，内部果肉会出现硬度增加、口感粗糙、出汁率下降、木质素含量上升等现象(林瀚,童志红,林河通,et al.枇杷采后冷害发生机制及其预防技术研究进展.福建农业学报[j],2023.38:245-252.)。因此，根据果蔬冷害发生相关的关键标志物，根据其对果蔬采后的抗冷性进行评价，以及冷害发生提前预测，能够帮助指导果蔬采后冷链物流的技术进行优化，减少果蔬采后因冷害发生产生的损失。
3、果蔬采后冷害发生已经被发现与果胶代谢变化相关。果蔬冷害发生后，果胶组分尤其是同聚半乳糖醛酸组分(hg)无法正常解聚和降解，去甲酯化积累了大量的低甲酯化hg和未低甲酯化hg，且未甲酯化hg能够进一步与ca2+结合形成果胶酸钙结构—“蛋盒结构”。(huang w,shi y,yan h,et al.the calcium-mediated homogalacturonan pectincomplexation in cell walls contributes the firmness increase in loquat fruitduring postharvest storage.journal of advanced research[j],2022.)(侯娇,严丹丹,黄美珠,et al.果胶甲酯化修饰与果实质地变化研究进展中国食品学报[j],2022.22:441-449.)。
4、目前主要使用的分析方法是基于化学提取法分析果蔬中的细胞壁果胶组分含量。发生冷害的果蔬中不同果胶组分含量的变化趋势与正常软化果蔬中的含量变化趋势相反。但是化学提取法费时费力，且提取过程对多糖的结构具有一定的破坏性。难以获取hg果胶精细的结构变化和分布的变化，因此也无法精准分析果蔬的抗冷性变化和对冷害发生进行预测。
5、免疫组化技术基于特异性抗体-抗原反应，可实现靶标免疫分子在组织背景下的检测和定位。目前已经开发出了针对特异识别植物细胞壁多种组分的抗体，并结合荧光二抗可实现多种精细植物细胞壁组分结构的原位标记成像(vandenbosch k a,bradley d j,knox j p,et al.common components of the infection thread matrix and theintercellular space identified by immunocytochemical analysis of pea nodulesand uninfected roots.embo j[j],1989.8:335-341.)；(knox j p,linstead p j,kingj,et al.pectin esterification is spatially regulated both within cell wallsand between developing tissues of root apices.planta[j],1990.181:512-521.)；(liners f o,thibault j-f o,van cutsem p influence of the degree ofpolymerization of oligogalacturonates and of esterification pattern of pectinon their recognition by monoclonal antibodies 1.plant physiology[j],1992.99:1099-1104.)；(verhertbruggen y,marcus s e,haeger a,et al.an extended set ofmonoclonal antibodies to pectic homogalacturonan.carbohydr res[j],2009.344:1858-1862.)；(haas k t,wightman r,meyerowitz e m,et al.pectin homogalacturonannanofilament expansion drives morphogenesis in plant epidermal cells.science[j],2020.367.)。因此，通过免疫组织化学技术对果蔬冷害相关的hg组分结构的标记，可以分析其精确结构分布和含量的变化趋势，从而对冷链物流过程中果蔬的抗冷性进行评价，并对冷害的发生进行预测。从而合理规划果蔬冷链物流过程，减少冷害发生，提升经济效益(huang w,shi y,yan h,et al.the calcium-mediated homogalacturonan pectincomplexation in cell walls contributes the firmness increase in loquat fruitduring postharvest storage.journal of advanced research[j],2022.)。
技术实现思路
1、本发明的目的在于解决当前冷链物流过程果蔬的冷害程度无法准确评价，果蔬在冷链物流过程中冷害的发展趋势不清，冷害发生后影响果蔬价值的问题，提供一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，不仅可以对当前果蔬的冷害程度进行评价，而且对当前果蔬抗冷性进行评价分级，基于抗冷性以对未来一段时间内果蔬的冷害发生概率进行预测，对指导果蔬冷链物流的规划具有重要的指导意义。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，包括以下步骤：
3、步骤1、对果蔬进行随机抽样，抽取果蔬样本x个，并依次编号为：1、2、3……x；
4、步骤2、对于抽取的每一个样本，取1cm3样本，获取一张徒手切片；随后将剩余样本用石蜡包埋，获取连续5张石蜡切片；
5、步骤3、使用化学荧光探针，对每个样本获取的徒手切片中的游离ca2+进行标记；对每个样本获取的5张石蜡切片分别使用lm20、jim7、jim5、lm19、2f4抗体，对高甲酯化hg、部分甲酯化hg、低甲酯化hg、未甲酯化hg和蛋盒结构进行免疫组织化学荧光标记；
6、步骤4、通过激光共聚焦显微镜获取样本中高甲酯化hg、部分甲酯化hg、低甲酯化hg、未甲酯化hg和蛋盒结构的抗体标记荧光分布图，分别统计该批次全部样本每种hg结构在荧光分布图中的薄壁细胞区域的荧光强度总和fall；然后再统计一下全部样本每种hg结构在荧光分布图中，荧光强度值最暗的10％部分的平均值funit，视为一个抗体标记单元；随后用荧光强度总和除以标记单元的荧光强度值，得出每种hg结构的归一化含量值；最后再乘以每种抗体单元识别的果胶单元骨架个数，计算该批次全部样本每种hg果胶结构的含量系数c，此处蛋盒结构也认为是果胶的一种：
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12、a、b、c、d、e为2f4、lm19、jim5、jim7、lm20抗体1个单位识别的果胶单元骨架个数，分别为9、5、6、6、5；
13、步骤5、通过激光共聚焦显微镜获取样本徒手切片中游离ca2+的荧光分布图，分别统计该批次全部样本中游离ca2+在荧光分布图中的胞外区域e的荧光强度总和fe、胞内区域i的荧光强度总和fi,胞外区域的面积se和胞内区域的面积si；根据公式，计算该批次全部样本胞外区域和胞内区域游离ca2+的平均浓度系数，分别记为eca和ica；
14、eca＝fe/(se*f)
15、ica＝fi/(si*f)
16、f为归一化系数；
17、步骤6、根据所获得的系数，计算样本中低甲酯化hg和未甲酯化hg占总果胶含量的占比，分别记作：pjim5和plm19；计算样本中胞外区域和胞内区域游离ca2+浓度比重，分别记作和进一步，根据公式计算果蔬短期发生冷害的系数ps、中期发生冷害的系数pm、长期发生冷害的系数pl、抗冷性系数rtc：
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26、ps≤0.1时候，认为1周内果蔬抗冷性较好，当ps＞0.1时候，值越大，则代表冷链物流过程1周内，该批次果蔬发生冷害的概率越大；
27、pm≤0.3时候，认为3周内果蔬抗冷性较好，当pm＞0.3时候，值越大，则代表冷链物流过程3周内，该批次果蔬发生冷害的概率越大；
28、pl≤0.4时候，认为4周内果蔬抗冷性较好，当pl＞0.4时候，值越大，则代表冷链物流过程4周内，该批次果蔬发生冷害的概率越大；
29、rtc≤0.4时候，认为当前果蔬品质较好，没有冷害发生；当rtc＞0.4时候，果蔬冷害已经发生；rtc值越大，冷害程度越高。
30、作为优选，步骤4中获取荧光分布图时，使用的仪器参数应保持一致，且使所有荧光分布图中不出现过曝点。
31、作为优选，步骤4中获取荧光分布图时，使用8-bit格式，每个像素点的荧光强度范围为0-255。
32、作为优选，步骤5中使用8-bit格式的荧光图，f取255。
33、作为优选，根据ps、pm、pl、以及rtc值制定果蔬的贮运和销售策略：
34、根据ps、pm、pl、以及rtc值制定果蔬的贮运和销售策略：
35、当rtc≤0.4时，且ps≤0.1、pm≤0.3、pl≤0.4时，果蔬适合优价出售、或者4周及以上贮藏和转运；
36、当rtc≤0.4时，且ps≤0.1、pm≤0.3、pl＞0.4时，果蔬适合优价出售、或者不超过4周的贮藏和转运；
37、当rtc≤0.4时，且ps≤0.1、pm＞0.3时，果蔬适合优价出售、或者不超过3周的贮藏和转运；
38、当rtc≤0.4时，且ps＞0.1时，果蔬适合1周以内优价出售、或者及时调整果蔬的贮藏条件；
39、当rtc＞0.4时，果蔬应该尽快结束贮藏和转运，就近打折出售。
40、本发明采用化学荧光探针对果蔬中的游离ca2+进行标记，采用不同的抗体分别对不同的果蔬中五种果胶分别进行标记，然后采用荧光图谱进行归一化分析，不仅可以评价果蔬当前阶段的冷害情况，而且可以对未来一段时间内的冷害趋势进行预测，作为冷链物流规划的依据，减少果蔬冷害的发生。
1.一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，步骤4中获取荧光分布图时，使用的仪器参数应保持一致，且使所有荧光分布图中不出现过曝点。
3.根据权利要求1所述的一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，步骤4中获取荧光分布图时，使用8-bit格式，每个像素点的荧光强度范围为0-255。
4.根据权利要求1所述的一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，步骤5中使用8-bit格式的荧光图，f取255。
5.根据权利要求1所述的一种用于冷链物流过程果蔬的冷害评价及预测方法，其特征在于，根据ps、pm、pl、以及rtc值制定果蔬的贮运和销售策略：
