本发明涉及转基因及植物病害防治领域，具体涉及一种水稻脂氧合酶编码基因在抗水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒中的应用。
背景技术：
1、水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)是纤细病毒属(tenuivirus)的一种负链单链rna(-ssrna)病毒，其病毒颗粒为直径3-8nm，长度不等的无包膜细丝体，主要由灰飞虱(laodelphax striatellus)传播，其基因组按分子量递减的顺序分别命名为rna1、rna2、rna3和rna4，编码7种蛋白质。其中，最大的rna1在互补链上编码一个337kda的rna依赖的rna聚合酶。而其他三个rna各自具有双向编码策略，在rna的5'端的开放读框编码蛋白p2-p4，在互补链上的orf编码蛋白pc2-pc4。pc2通过克服昆虫障碍参与媒介传播，p2蛋白行使沉默抑制子和转录抑制子功能，并且可以靶向茉莉酸(ja)通路的关键模块来抑制ja通路；pc3是一种核衣壳蛋白；p3是一种沉默抑制蛋白，受到植物细胞自噬的调控，与宿主蛋白竞争双链和单链sirna以阻止沉默复合物的形成；pc4(32kda)主要分布在细胞壁附近或细胞壁内，被认为是一种运动蛋白；p4是一种非结构特异性蛋白。
2、目前生产上推广的大多数水稻抗病品种存在抗性基因较少、位点单一的问题，防治水稻条纹叶枯病最经济有效的措施仍然是培育抗性品种，因此，研究能够防治rsv的转基因材料极具现实意义，可以为作物抗病育种提供重要的理论及技术支持。
3、南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus，srbsdv)是斐济病毒属(fijivirus)的一员，其病毒粒体为直径75-80nm的正二十面体球状结构，具有双层衣壳，无包膜，主要由白背飞虱(sogatella furcifera)传播，但是不经卵传播。srbsdv的基因组由10条双链rna组成，共编码13种蛋白，包括6种结构蛋白(p1、p2、p3、p4、p8、p10)和7种非结构蛋白(p5-1、p5-2、p6、p7-1、p7-2、p9-1、p9-2)。结构蛋白p1为病毒rna依赖的rna聚合酶；p2为病毒内核的组分；p3为加帽酶；p4为病毒外壳的b刺突蛋白；p8是病毒的核心衣壳蛋白，可以与水稻生长素途径转录因子osarf17互作促进病毒侵染；p10是病毒的外层衣壳蛋白，可以激发内质网应激反应；非结构蛋白p5-1是病毒原质的组分，呈丝状结构分布，参与病毒粒体的复制与装配；p6具有沉默抑制子功能，研究发现其通过与乙烯信号途径关键转录因子osrth2互作协调病毒感染和传播；p7-1可以在非寄主细胞内独立装配形成小管结构，且能够参与病毒的扩散；p7-2可以与osskp1相互作用形成scf复合物；p9-1是病毒原质的组分，与病毒的复制有关。
4、南方水稻黑条矮缩病在水稻各生育期均可感染，并且不同生长期都有其典型的症状。在秧苗期和本田初期，其症状表现为植株矮缩，严重时可导致死亡。水稻分蘖期和拔节期被侵染后无明显矮缩现象，其症状主要表现为叶色深绿、叶背及茎秆出现条状乳白色或深褐色小突起、高位分蘖、根系不发达、后期抽穗少、结实率低。目前培育抗srbsdv的抗病品种仍然是最高效的防治手段，因此，研究能够防治srbsdv的转基因材料具有极为重要的现实意义。
5、茉莉酸(jasmonic acid,ja)及其代谢产物作为一类广泛存在于植物界的含氧化合物脂基激素，在植物免疫和生长发育中扮演着重要的角色。然而，ja在植物抗病毒防御中的作用存在争议，在拟南芥和水稻中进行的研究表明，ja正向调节植物的抗病毒防御。然而，对本氏烟草的研究表明，ja在植物抗病毒防御中起着负面作用。ja的生物合成途径源自于叶绿体膜中亚麻酸或者α-亚麻酸的酯化。在叶绿体中，脂氧合酶(lox)、氧化烯合酶(aos)和氧化烯环化酶(aoc)催化α-lea转化为12-氧代植物二烯酸(opda)。opda在过氧化物酶体中通过酶opr3和acx1进一步转化为ja-ile，这一步骤对ja感知和信号传导至关重要。在水稻中鉴定到16个lox基因，命名为oslox1-oslox16。lox基因作为ja生物合成中的第一个关键生物合成酶，根据亚油酸(la)和α-lea氧化过程中分子氧插入的位置，将其分为9-lox和13-lox。13-lox途径通常被认为参与ja生物合成，然而oslox14是否可以增加水稻中ja的含量以及增加水稻对rsv和srbsdv的抗性仍不清楚。
6、基于现有技术的上述缺陷，本发明通过构建oslox14的过表达载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种(例如：日本晴)中，获得可稳定遗传的两个转基因水稻，分别命名为oslox14-oe#3和oslox14-oe#4，实验结果表明在水稻中过表达oslox14基因，能显著增加水稻中的茉莉酸含量。此外，通过人工接种水稻条纹病毒(rsv)和南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)，发现在水稻中过表达oslox14基因，能显著增强水稻对rsv和srbsdv侵染的抗性，表现为植株发病症状减轻，病毒含量减少等。本发明为针对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性植物育种、选育水稻抗病毒新品种提供新的思路，为确保农业水稻作物不断增产提供技术保障，取得了预料不到的技术效果。
技术实现思路
1、本发明涉及一种水稻脂氧合酶编码基因oslox14及其编码蛋白。
2、一方面，所述oslox14基因,其核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、另一方面，所述oslox14基因，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、在一些实施方案，水稻脂氧合酶编码基因oslox14的核苷酸序列(seq id no:1)如下：
5、atgctcacggccacgcagactctggcgccggcagtgctctcccggagccatggcgccccttcttccttctccagccagccgcgccgcaccgccgccgccgcctcgagagtaagctgcacccgcgtcggcgccttgtcggaggtcgtcaatggcgaactcgtcgtcggcgaccaagaacagacgaccgacgacctccttacgcggcacaagaatgtcgtcgccgactacacgctgagcgccacggtgacggtgagcttgaagcaggacgattccactccccagaaggtggcggacatggttaatcgagactggcttttccttgatttcttcagctcgcatatagaggggatgcacacggagcctcagctcgccaggtactcgcacatggatggcaaaggctccttcatatacgaggccagcttcagcatcccgtcctcgttggacgccgtcggcgccgtgcaggtcgtgaaccgctacagcagcgaggtgtacatctcggacatcgacgtccacctctgcggcggccgccatcagtggaccgacatcactttccactgcaactcttggatcgactacaaccccaacgaccagcgcttcttcttccctctcaagtcgtacctcccgtctcagacgcccaggggcgtgaagaatctgcgcaaggaagagctcagggccatccgcggcgatggccgcggcgagcgcaaggagtgggagcgcatctacgactacgacgtctacaacgacctcggcgaccccgacaatgacccggccactcgtcggccggtgctcggcggccgcgggcgcccctacccgcgccgctgccgcacgggccgccgccgctgcaggacagacccgtcgtcggagtcgccgccggccaaggacggcgccgggatctacgtgccacgggacgaggcgttcacggagcggaaggccggcgcgttcgccaccaagaaggcgctgtcggcgctgtcggcgttcaccacggcgcagagggtgtccggcgaccggcggcggggcttcccgtcgctggcggccatcgacgcgctgtacgaggacgggtacaagaaccggccgtcgtcgtcgcagcaggaggcggacaacctcgaaggctacttcagggaggtgctccagaagcaggtgaagctgctgctcaagggcgagaaggaggagttcaaggaggagctacgcaaagtgttcaaattccaaacgcccgagattcacgacaaggacaagcttgcatggttcagaga cgaggagttcgcgcggcaaacgctggcagggatgaaccctctcagcatccaacttgtcagggacacggacttccctatattcagcaagctggacgaggaaacctacggcccaggggactccctcatcaccaaagagctgattgaagagcagattaatggggtcatgacagcagaggaggccgtggagaagaagaagctgttcatgctggactaccacgacgtgctcctgccgttcgtgcacgcggtgcgcgagctggacgacaccacgctgtacgcctcgcggacgctcttcttcctgacggaggacggcacgctgaggccgatcgccatcgagctgacgaggcccaagtcccccaacacgccgcagtggcgccaggtcttcacgccgggctccagcgtcgcggcgtcctggctgtggcagctcgccaaaacgcacgtcctcgcccacgacaccggctaccaccagctcgtcagccactggctgaggacgcactgctgcgtggagccgtacgtgatcgcggcgaaccggcggctgagccagatgcaccccatctaccgactgctgcacccgcacttccgcttcaccatggagatcaacgcccaagcgcgcgggatgctcatcaacgccaatggaatcatcgagagcgccttcgcgccggggaagctctgcatggagctcagctcggcggtttacgacaagttttggaggttcgacatggaggctctgcccgccgatctcatccggaggggcatggcgatcgaatgcgaggatggcaagctggagctgacgatagaggactacccgtacgccaacgacggcctgctcatctgggactccatcaaggagtgggtgtcggattatgtgaaccattactaccagttggcttcagacatccacatggacaaggagctccagggttggtggaacgaggtgcgaaccaagggccacccggacaaggaggaagggtggccagagctgaactgccacgggagcctcgtcgaggttctgaccaccatcatctgggtcgcgtcggggcaccatgcggcggtgaactttggccagtacccctacgccggctacttccccaatcgccccaccatcgcccggcggaacatgccgacggaggggcaggcgtgcagtcacgacggcatgcagccaacgttcgttgaggatcccgtcagggtgctactagacacgttcccatcgcagtaccagaccaccctcgtcctgccggtgctcaacctgctatcgtcacactcgcccggcgaggagtacatgggcacgcatgcggagtcagcgtggatggcggacagggaggtcagggcggcgttcgggaggttcaacgagaggatgatgagcatcgcggagatgatcgactgccggaacaaggatccggagcgaaagaaccggcagggccccggcgtggtgccgtacgtgctgctcaagccgtcctacggtgaccctaaggacatgacgtccgtgatggagatgggtatccccaacagcatctcaatttga
6、水稻脂氧合酶编码基因oslox14的氨基酸序列(seq id no:2)如下：
7、mltatqtlapavlsrshgapssfssqprrtaaaasrvsctrvgalsevvngelvvgdqeqttddlltrhknvvadytlsatvtvslkqddstpqkvadmvnr dwlfldffsshiegmhtepqlaryshmdgkgsfiyeasfsipssldavgavqvvnryssevyisdidvhlcggrhqwtditfhcnswidynpndqrfffplksylpsqtprgvknlrkeelrairgdgrgerkeweriydydvyndlgdpdndpatrrpvlggrgrpyprrcrtgrrrcrtdpssesppakdgagiyvprdeafterkagafatkkalsalsafttaqrvsgdrrrgfpslaaidalyedgyknrpsssqqeadnlegyfrevlqkqvklllkgekeefkeelrkvfkfqtpeihdkdklawfrdeefarqtlagmnplsiqlvrdtdfpifskldeetygpgdslitkelieeqingvmtaeeavekkklfmldyhdvllpfvhavrelddttlyasrtlffltedgtlrpiaieltrpkspntpqwrqvftpgssvaaswlwqlakthvlahdtgyhqlvshwlrthccvepyviaanrrlsqmhpiyrllhphfrftmeinaqargmlinangiiesafapgklcmelssavydkfwrfdmealpadlirrgmaiecedgkleltiedypyandglliwdsikewvsdyvnhyyqlasdihmdkelqgwwnevrtkghpdkeegwpelnchgslvevlttiiwvasghhaavnfgqypyagyfpnrptiarrnmptegqacshdgmqptfvedpvrvlldtfpsqyqttlvlpvlnllsshspgeeymgthaesawmadrevraafgrfnermmsiaemidcrnkdperknrqgpgvvpyvllkpsygdpkdmtsvmemgipnsisi
8、另一方面，本发明涉及所述水稻脂氧合酶编码基因oslox14抗纤细病毒属(tenuivirus)和斐济病毒属(fijivirus)在禾本科粮食作物育种中的应用。
9、在一些实施方案中，所述纤细病毒属(tenuivirus)优选水稻条纹病毒(ricestripe virus,rsv)、玉米条纹病毒(maize stripe virus,mspv)；最优选水稻条纹病毒(rice stripe virus,rsv)；所述斐济病毒属(fijivirus)优选玉米粗缩病毒(maize roughdwarf virus，mrdv)、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus，rbsdv)南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus，srbsdv)；最优选南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black streaked dwarf virus，srbsdv)。
10、在一些实施方案中，所述禾本科粮食作物优选水稻，玉米，小麦，燕麦和大麦；更优选水稻，最优选日本晴。
11、另一方面，本发明涉及一种抗水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒转基因植物的制备方法，其步骤包括：
12、1)水稻oslox14表达载体构建；
13、2)水稻遗传转化、农杆菌转化与愈伤组织诱导培养
14、3)阳性转基因植株的鉴定；
15、在一些实施方案中，所述水稻oslox14表达载体构建步骤进一步包括：
16、根据seq id no.1所示的oslox14的序列设计引物，从水稻的cdna中克隆出oslox14的全长序列，将pcr产物胶回收；用bamhi、saci酶切含有flag标签的pcambia1300载体后，将上所述pcr产物分别与载体连接，挑选阳性克隆，测序，确认已成功构建pcambia1300-oslox14表达载体。
17、在一些实施方案中，所述水稻遗传转化、农杆菌转化与愈伤组织诱导培养的步骤进一步包括：
18、愈伤组织诱导：挑选成熟水稻种子，剥离颖壳，倒入离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠消毒20min，倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍；使用移液枪吸去多余的水分，将种子转移到诱导培养基上，放于28℃光照培养箱培养3周，将长出的愈伤组织，用提前灭好菌的镊子夹到继代培养基中，28℃光照培养箱继代培养1周；
19、农杆菌的转化和培养：将含有目的载体的质粒转化根瘤农杆菌gv3101，采用以下步骤：取5μl质粒加到100μl的农杆菌gv3101感受态中，使用移液枪吹打混匀，加入到无菌并且提前4℃预冷的电极杯中，利用电击法在220v的电压下进行电击转化，加入无抗性的lb液体培养基，28℃恒温摇床震荡培养3h左右，均匀涂布在含50μg/ml kan及50μg/ml rif的lb固体培养基上，28℃黑暗培养2天至出现单菌落。
20、农杆菌侵染：准备侵染液，用移液枪吸取侵染液将平板上的农杆菌冲洗下来即共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。挑选足够数量的愈伤组织，放入100ml无菌三角瓶中,加入适量农杆菌悬浮液，室温放置侵染20min，并不时晃动。倒掉菌液,将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液,随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。
21、筛选培养：共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1ml的蓝枪头将共培养基上的愈伤播到已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两边，第三遍用含有500ul/l羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到含有潮霉素b的培养基上进行筛选培养，培养条件28-30℃，暗培养。筛选时长3-4周。
22、幼苗生根：待分化出的幼苗长到2-3cm左右，有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养基要倒在比较高的瓶子或管子里，生根后的苗子才有足够的空间长高，生根培养条件28-30℃，无菌光照培养。
23、在一些实施方案中，所述阳性转基因植株的鉴定的步骤进一步包括：
24、使用trizol试剂提取阳性转基因植株和对照植株(nip)的总rna，逆转录为cdna，水稻osubq5作为内参基因。定量引物如seq id no.7-10所示，过表达oslox14基因的两个转基因株系中oslox14相对表达量显著高于对照组，分别命名为oslox14-oe#3和oslox14-oe#4，证明转基因水稻品系构建成功。
25、在一些实施方案中，所述阳性转基因植株的鉴定的步骤进一步包括：
26、通过液相色谱-串联质谱技术测量过表达oslox14转基因株系中的茉莉酸(ja)含量。
27、在一些实施方案中，所述阳性转基因植株的鉴定的步骤进一步包括：
28、通过人工接种rsv和srbsdv来检验过表达oslox14转基因株系对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性。
29、在一些实施方案中，所述诱导培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、ph＝5.8。
30、在一些实施方案中，所述继代培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
31、在一些实施方案中，所述生根培养基包含：1/2ms 39.45g/l、0.5mg/l naa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
32、在一些实施方案中，所述共培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、200μmol/l的乙酰丁香酮、ph＝5.2。
33、与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
34、1)本发明通过构建oslox14的过表达载体，利用农杆菌介导法导入水稻品种(日本晴)中，获得可稳定遗传的两个转基因水稻，分别命名为oslox14-oe#3和oslox14-oe#4。并测量过表达oslox14转基因株系中的ja含量以及对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的抗性分析，有助于加深我们对水稻病毒与ja相互作用的理解和认识，丰富水稻与rsv和srbsdv相互作用的分子机制。
35、2)本发明通过使用液相色谱-串联质谱技术测量过表达oslox14转基因株系中的茉莉酸含量，发现一种水稻脂氧合酶oslox14能够有效地促进ja在水稻中的积累，极大丰富了水稻抗病理论的研究方向。
36、3)本发明通过对水稻脂氧合酶oslox14在rsv和rsbsdv侵染过程中的作用机制研究，从中发现水稻与病毒之间的互作关系，为进一步选育抗性品种奠定基础。
1.一种水稻脂氧合酶编码基因oslox14在抗水稻条纹病毒(rsv)或南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的水稻育种中的应用，所述水稻脂氧合酶编码基因oslox14的核苷酸序列如seq id no.1所示，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.权利要求1所述的应用，所述水稻为日本晴。
3.一种抗水稻条纹病毒南方水稻黑条矮缩病毒转基因植物的制备方法，其步骤包括：
4.权利要求3所述的制备方法，所述诱导培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、ph＝5.8。
5.权利要求3所述的制备方法，所述继代培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、50mg/l潮霉素、300mg/ml头孢霉素、ph＝5.8。
6.权利要求3所述的制备方法，所述生根培养基包含：1/2ms 39.45g/l、0.5mg/l naa、50mg/l潮霉素、ph＝5.8。
7.权利要求3所述的制备方法，所述共培养基包含：n6培养基24.1g/l、2mg/l 2,4-d、200μmol/l的乙酰丁香酮、ph＝5.2。
8.一种提高水稻对水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒抗性的方法，将水稻脂氧合酶oslox14基因转入水稻中，所述oslox14基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.一种检测水稻条纹病毒和南方水稻黑条矮缩病毒抗性植株的方法，其步骤包括：
