本发明涉及电子医疗仪器，更具体地，涉及一种酶联免疫斑点图像采集方法。
背景技术：
1、随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。在研究免疫应答机制时，以往人们常用酶联免疫吸附试验(elisa)检测体液中游离的细胞因子(ck)或抗体，但由于游离的循环抗体或ck半衰期不同，使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合，而不能确切地反应体内抗体及ck水平。90年代中期，sedgwick、holt和czerkinsky等根据elisa技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和ck分泌细胞的固相酶联免疫斑点(elispot)技术。
2、酶联免疫斑点(elispot)技术由于具有较高的敏感性和特异性，操作简单方便，已日益成为免疫学研究的主流技术，被广泛应用于免疫学相关各领域。而对于酶联免疫斑点的分析，是该技术发展不可或缺的一个环节。
3、现有技术中，主要采用酶联斑点分析仪，该分析仪分析计数不够准确且不能自动去除杂质，所以没有得到广泛应用，现在医生或研究人员直接通过放大镜观察酶标板，对酶标板上斑点人工计数，较难看清且无法长期留存。
技术实现思路
1、本发明提供一种酶联免疫斑点图像采集方法，以解决现有酶联斑点人工计数不方便实现自动化，且不便于计算机辅助斑点计算的问题。
2、根据本发明的一个方面，提供一种酶联免疫斑点图像采集方法，包括以下步骤：
3、步骤a1，将酶标板固定在多轴运动平台上，用带弹簧的卡扣顶紧酶标板，调整平台并补充光源，使酶标板孔位到拍照光路下方；
4、步骤a2，找到酶标板孔位薄膜对焦点z轴位置以及酶标板孔位薄膜中孔的圆形区域及薄膜中心位置；
5、步骤a3，移动酶标板使孔位薄膜中心位于显微相机图像正中间，以对焦点z轴坐标为中点，向z轴正负方向各扩展n×lum，得到z轴深度扫描范围2×n×l，其中，n表示步数，l表示步长，从z轴坐标由小到大间隔lum拍照，将图片按圆形区域外接矩形范围裁剪下来，并将圆形区域外像素设置为全白；
6、步骤a4，对裁剪后的2n+1张图片，用laplace算子计算出每张图片的laplace梯度矩阵，选择每个位置laplace梯度最大的图片的对应像素点来填充成最终的融合图像。
7、在上述方案基础上优选，所述步骤a1包括:步骤a11，将酶标板用带弹簧的卡扣固定在多轴运动平台上，调整平台位置使酶标板孔位到显微拍照光路下方；步骤a12，用环绕物镜的环形led灯打光，使酶标板孔位薄膜上的光照均匀。
8、在上述方案基础上优选，所述步骤a2找到酶标板孔位薄膜对焦点z轴位置，具体包括：在z轴方向小步进从小到大坐标高度拍照，将拍照得到的每张图像均匀分割为4×4份，取中间4张图像用laplace算子计算散度，将每个高度4张图像的散度连成4条曲线，采用laplace梯度法找到4条曲线上的峰值点对应的z轴坐标，取平均值即为对焦点z轴位置。
9、在上述方案基础上优选，所述步骤a2找到酶标板孔位薄膜中孔的圆形区域及薄膜中心位置，具体包括：取对焦点z轴位置拍摄的图像，用otsu方法对图像二值化，再用霍夫圆检测方法在图像中找到若干个圆，计算多个圆的中心点、半径平均值，即为最终确定的薄膜孔的圆形区域，此圆的圆心即为薄膜中心位置。
10、本发明的一种酶联免疫斑点图像采集方法，通过采用多轴运动平台和显微相机配合，可以自动调整快速找到酶标板孔位薄膜对焦点z轴位置以及酶标板孔位薄膜的圆形区域及薄膜中心位置，然后以薄膜中心位置为图像中心，以l步长从对焦点z轴位置上下n步范围拍摄2n+1张图片，融合出最清晰图像，并沿孔位圆形区域将图像裁剪为圆形。
1.一种酶联免疫斑点图像采集方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点图像采集方法，其特征在于，所述步骤a1包括:步骤a11，将酶标板用带弹簧的卡扣固定在多轴运动平台上，调整平台位置使酶标板孔位到显微拍照光路下方；步骤a12，用环绕物镜的环形led灯打光，使酶标板孔位薄膜上的光照均匀。
3.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点图像采集方法，其特征在于，所述步骤a2找到酶标板孔位薄膜对焦点z轴位置，具体包括：在z轴方向小步进从小到大坐标高度拍照，将拍照得到的每张图像均匀分割为4×4份，取中间4张图像用laplace算子计算散度，将每个高度4张图像的散度连成4条曲线，采用laplace梯度法找到4条曲线上的峰值点对应的z轴坐标，取平均值即为对焦点z轴位置。
4.如权利要求1所述的一种酶联免疫斑点图像采集方法，其特征在于，所述步骤a2找到酶标板孔位薄膜中孔的圆形区域及薄膜中心位置，具体包括：取对焦点z轴位置拍摄的图像，用otsu方法对图像二值化，再用霍夫圆检测方法在图像中找到若干个圆，计算多个圆的中心点、半径平均值，即为最终确定的薄膜孔的圆形区域，此圆的圆心即为薄膜中心位置。
