本发明涉及病毒快速定量检测领域，具体为量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡。
背景技术：
1、猪繁殖与呼吸综合征(prrs)是猪群发生的一种急性、高度传染性、流行性高的以繁殖障碍和呼吸系统症状为特征的病毒性传染病，常引起妊娠母猪流产、产死胎，导致猪群生产性能下降、生长缓慢、免疫功能下降，容易继发感染其他细菌性和病毒性疾病，从而加大猪群疾病防控的难度。prrs主要由猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)导致，存在空气传播，接触传播，精液传播和垂直传播，可严重影响猪场的经济效益。
2、prrs易发生持续性感染，prrs病暴发后猪场较难恢复平静，因为prrsv的病毒血症持续时间较长，长达45天以上。猪群的不同个体处于感染的不同阶段，导致了病毒在猪群中的循环传播。prrsv不断从感染猪或携带猪向易感猪进行传播，周而复始，循环往复，造成疾病持续不断。
3、市场上的疫苗毒株繁多，每种疫苗对不同毒株的交叉保护性尚存争议。并且prrsv还有特有的抗体依赖性增强特性，当猪群体内prrsv抗体含量比较低时，低水平的prrsv抗体不仅不能有效清除血液中的prrsv，反而会增强其在猪体内的复制和繁殖作用，造成持续感染，给猪场防控带来了难题。
4、prrsv在巨噬细胞内定植、复制，破坏免疫器官，导致较为严重的免疫抑制，在此基础上，易发生各类混合感染及继发感染，如保育猪出现副猪嗜血杆菌、链球菌感染，育成猪发生传染性胸膜肺炎感染等等。市场上的部分prrsv疫苗由于疫苗株毒力较强，也通常容易引起免疫抑制，这也是有些猪场细菌性疾病频发的原因之一。
5、目前prrs主要的防控手段是疫苗免疫和药物保健，但是疫苗免疫时间和毒株类型，药物保健剂量这些参数需要经验丰富的临床兽医进行判断。目前我国专职驻场的临床兽医数量很少，不能及时对各个发病猪场进行诊治，如果能通过检测手段进行评估并指导预后将是临床防治prrs的一大优势，可便于临床饲养工作者通过快速精准检测的数据结果早期发现并预警疫病，指导临床疫苗免疫和药物保健。
6、prrsv是单股正链rna病毒，大小约15.4kb，共含有11个开放阅读框(orf)，具有高度变异特性。prrsv的主要结构蛋白包括gp5蛋白、m蛋白、n蛋白，其中gp5蛋白由orf5编码，约26～30kd，在prrsv的抗体识别过程中起关键作用，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白，是prrsv的主要保护性抗原，也是prrsv诊断的靶标抗原之一。
7、由于prrs传统检测pcr方法存在操作程序复杂、检测耗时长、需要昂贵的设备、有经验的技术人员和专业实验室，这些因素限制了其进一步应用，elisa方法又存在抗体滞后，无法定量检测，对设备和环境也有要求，尤其是即时现场检测应用领域，不能够及时高效，从而延误了疫情，导致更大的经济损失。因此开发一种简单、准确、快速，可实时定量检测的方法至关重要。
8、在猪传染性疾病流行期，早期快速诊断对于猪群治疗和疫情预警防控至关重要，目前猪繁殖与呼吸综合征常用的实验室检测方法主要包括病毒分离培养、核酸检测、酶联免疫吸附法、间接免疫荧光实验等。但这些方法需要配备完善的实验室及特殊仪器设备，操作复杂且耗时较长，难以满足现场快速检测的需求。目前应用最广泛的现场快速检测技术是胶体金免疫层析法，该技术以简便、快速、半定量等优点被视为目前最有潜力的现场快速检测工具，且操作简便，可在15min内呈现结果，非常适合现场快速检测。但胶体金免疫层析法的灵敏度较低。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明提供了量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，本发明适用于发病猪全血、血清、唾液、组织(肺脏、脾脏)研磨液、睾丸处理液内prrsv抗原的检测，可在短时间内诊断出prrsv感染，特别适合现场prrsv感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。其与便携免疫荧光分析仪协同使用，可直接显示检测结果，根据检测值预警临床风险；使用方便、操作迅速简单、准确率高，避免人为因素干扰，具有很强的实用性。
2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
3、量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，包括pvc背板，所述pvc背板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫对应的区域分别为加样区、反应区、检测区、质控区和吸水区；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线t线和质控线c线，检测线t线包被prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体gp5-mab1，质控线c线包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；所述结合垫含有prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体量子点荧光标记-gp5-mab2和鼠igg抗体。
4、作为本发明进一步的方案，所述检测线t线prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体mab1-gp5工作浓度为0.5-1.5mg/ml。
5、作为本发明进一步的方案，所述量子点荧光微球标记量为10 -50μg/cm，喷涂量为2 -8μl/cm，干燥温度为15-50℃。
6、作为本发明进一步的方案，所述结合垫prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体mab2-gp5包被量为0.5-3.5μg/cm。
7、作为本发明进一步的方案，所述羊抗鼠igg多克隆抗体工作浓度为0.2-2.0mg/ml。
8、作为本发明进一步的方案，所述鼠igg抗体工作浓度为0.2-2.0mg/ml。
9、作为本发明进一步的方案，划膜时抗体喷涂量为0.2-2.0μl/cm，且检测线与质控线之间距离为2-6mm。
10、作为本发明进一步的方案，所述检测线t线prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体mab1-gp5工作浓度为1.0mg/ml；量子点荧光微球标记量为25μg/cm，喷涂量为5.0μl/cm，干燥温度为37℃；结合垫prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体mab2-gp5包被量为2.0μg/cm；羊抗鼠igg多克隆抗体工作浓度为1.0mg/ml；鼠igg抗体工作浓度为1.0mg/ml；划膜时抗体喷涂量均为1.0μl/cm，且检测线与质控线之间距离为4mm。
11、本发明具有以下有益效果：
12、本发明适用于发病猪全血、血清、唾液、组织(肺脏、脾脏)研磨液、睾丸处理液内prrsv抗原的检测，可在短时间内诊断出prrsv感染，特别适合现场prrsv感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验。其与便携免疫荧光分析仪协同使用，可直接显示检测结果，根据检测值预警临床风险；使用方便、操作迅速简单、准确率高，避免人为因素干扰，具有很强的实用性；
13、本发明不限于用本检测方法检测的prrsv gp5蛋白抗原，亦包括其它的可用于检测的prrsv抗原；抗体亦可相应换成针对猪繁殖与呼吸综合征病毒其他蛋白的单克隆抗体或多克隆抗体，具有广泛的适用性；
14、本发明应用于免疫层析平台开发出量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，成功实现猪繁殖与呼吸综合征抗原定性和定量检测，结合仪器根据拟合曲线定量判读可以初步判断猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的强弱，加快猪繁殖与呼吸综合征大规模快速筛查的进程和临床预警，可以进一步更精确指导动物免疫和科学用药。
15、本发明能够应用于免疫层析平台的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组gp5蛋白(即抗原)检测的配对单抗，工艺简单、产能高、成本低，特异性好，从根本上降低免疫层析检测卡的制造成本，双抗体夹心法提高了准确性，极大促进其在基层和一线广泛应用。
16、本发明选用新型的量子点纳米微球，可显著提高量子点的光稳定性、胶体稳定性及生物相容性，通过量子点荧光纳米微球标记，还能增加单位抗原/抗体标记量子点的数量，提高单位抗原/抗体标记量子点荧光信号，从而进一步提高检测灵敏度。同时，本发明通过定向标记途径，不仅可以使单位抗原/抗体定向标记的量子点纳米微球数量恒定，而且从技术层面优化了抗原/抗体和荧光信号标记物的空间排列，大大降低了非特异性吸附造成的系统性误差，极大提高了免疫层析技术平台的检测灵敏度和结果重现性，同时将cv值得到很好的优化，cv值控制难度大大降低，使免疫层析技术检测猪繁殖与呼吸综合征抗原/抗体成为现实。并且因为量子点荧光微球的发光颜色多样，还可以根据不同颜色的选择在临床实现鉴别诊断。
17、本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒快速定量检测卡检测操作温度适应范围宽，2～30℃范围内，稳定性测试一致，可方便运输和储存。
18、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对本发明进行详细说明。
1.量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，包括pvc背板，所述pvc背板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫对应的区域分别为加样区、反应区、检测区、质控区和吸水区；所述硝酸纤维素膜上依次设置有检测线t线和质控线c线，检测线t线包被prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体gp5-mab1，质控线c线包被有羊抗鼠igg多克隆抗体；所述结合垫含有prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体量子点荧光标记-gp5-mab2和鼠igg抗体。
2.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测线t线prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体mab1-gp5工作浓度为0.5-1.5mg/ml。
3.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述量子点荧光微球标记量为10-50μg/cm，喷涂量为2-8μl/cm，干燥温度为15-50℃。
4.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述结合垫prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体mab2-gp5包被量为0.5-3.5μg/cm。
5.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述羊抗鼠igg多克隆抗体工作浓度为0.2-2.0mg/ml。
6.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述鼠igg抗体工作浓度为0.2-2.0mg/ml。
7.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，划膜时抗体喷涂量为0.2-2.0μl/cm，且检测线与质控线之间距离为2-6mm。
8.如权利要求1所述的量子点荧光微球标记的免疫层析检测卡，其特征在于，所述检测线t线prrsv gp5蛋白抗原表位的检测抗体mab1-gp5工作浓度为1.0mg/ml；量子点荧光微球标记量为25μg/cm，喷涂量为5.0μl/cm，干燥温度为37℃；结合垫prrsv gp5蛋白抗原表位的捕获抗体mab2-gp5包被量为2.0μg/cm；羊抗鼠igg多克隆抗体工作浓度为1.0mg/ml；鼠igg抗体工作浓度为1.0mg/ml；划膜时抗体喷涂量均为1.0μl/cm，且检测线与质控线之间距离为4mm。
9.猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测方法，其特征在于，将待测样本采用权利要求1-8任一项所述的免疫层析检测卡进行检测，采用紫外手电照射，c线出现荧光条带说明试验质控成立，t线出现荧光条带，判定为阳性，即待测样本含有猪繁殖与呼吸综合征病毒；t线未出现荧光条带，判定为阴性，即待测样本不含猪繁殖与呼吸综合征病毒。
