本发明属于生物化学和海洋产物资源开发利用领域，具体地涉及一种熊果酸作为亲和树脂配基及其分离纯化藻蓝蛋白的应用。
背景技术：
1、亲和层析是一种高选择性和高效率的方法，可以从复杂混合物中分离出高纯度的特定蛋白质，特别是对于那些分离过程长、浓度低、杂质多、常规方法难以分离的生物分子，亲和层析具有不可比拟的优势。小分子和金属离子是研究最广泛的领域，价格低廉，来源广泛，已成为发展最快，应用最广泛的亲和材料。目前市面上有多种亲和填料商品试剂为亲和纯化的广泛应用提供了便利，应用时只需要连接特定配体小分子即可构成某一类蛋白特定的专用亲和树脂。
2、通过虚拟筛选和分子对接研究进行基于结构的亲和配体设计已成为建立亲和色谱方法的重要一步。通过虚拟筛选，可以从大量小分子数据库中虚拟筛选到与目的蛋白可以特异结合的小分子配体，通过计算机模拟分子对接，可以将蛋白质与小分子对接的复杂过程可视化，便于研究。
3、藻蓝蛋白是一种在蓝藻和一些隐藻中发现的捕光色素蛋白。它由藻胆素和脱辅基蛋白组成。藻蓝蛋白的最大吸收峰在620nm，藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗癌活性，还可以介导肿瘤光动力治疗，可作为光敏剂使用。
4、藻蓝蛋白的商业价值与其纯度成正比；纯度为0.7的藻蓝蛋白通常被认为是食品级，纯度在3.0到3.9之间相当于反应级，纯度>4.0被认为是分析级。藻蓝蛋白的纯度越高，其商业价值越高。由于藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白在螺旋藻中共存，因此藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离是纯化藻蓝蛋白的关键步骤。为了获得分析级的藻蓝蛋白，大多数纯化方法需要多步结合使用，如硫酸铵沉淀与离子交换色谱法、羟基磷灰石柱色谱法等柱色谱法结合。然而，这些方法繁琐且藻蓝蛋白收率低，不适合大规模生产。因此，为避免耗时的多步操作步骤，有必要寻找更高效和经济的藻蓝蛋白纯化方法。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题在于提供一种熊果酸作为亲和树脂配基及其分离纯化藻蓝蛋白的应用，本发明筛选特异结合藻蓝蛋白的小分子配体，制备出亲和树脂并建立用其纯化藻蓝蛋白的柱层析工艺。所述方法制备的藻蓝蛋白纯度达到4以上，符合分析级的标准。
2、本发明是通过如下技术方案来实现的：
3、熊果酸作为亲和树脂配基的应用，所述的应用为熊果酸作为分离纯化藻蓝蛋白的亲和树脂的配基。
4、一种纯化藻蓝蛋白的亲和树脂，所述的亲和树脂由熊果酸的羧基与氨基树脂的氨基通过酰胺键共价连接而成。
5、本发明还提供所述亲和树脂的制备方法，取小分子熊果酸溶于甲醇中，浓度不超过10mm，用甲醇清洗过的氨基树脂与熊果酸溶液按1：2的体积比混合，并向混合溶液中加入1-乙基(3-二甲氨基丙基)-3-碳二亚胺盐酸盐偶联剂粉末，避光过夜震荡，离心去除上清，用甲醇清洗沉淀，再以纯水清洗，之后用酸碱溶液交替清洗，获得亲和树脂，用20％乙醇溶液保藏。
6、本发明还提供所述亲和树脂的应用，所述的应用为利用亲和树脂分离纯化藻蓝蛋白。
7、作为优选的实施方式之一，所述应方法具体步骤如下：
8、第一步、制备藻蓝蛋白粗提液，以ph为7.0的20mm磷酸二氢钠-磷酸氢二钠结合缓冲液流过亲和树脂层析柱，平衡两个以上柱体积，将藻蓝蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗，洗去无法结合的杂蛋白，待蛋白检测基线(280nm吸光值)稳定，再加入含有50mm nacl的ph 4.0的20mm醋酸-醋酸钠洗脱缓冲液，以1ml/min的流速洗脱，根据洗脱颜色变蓝或检测到620nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液；计算藻蓝蛋白收集液的620nm和280nm吸光值的比值，确定藻蓝蛋白的纯度；
9、第二步、亲和树脂的再生，收集藻蓝蛋白洗脱峰后，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液ph为中性，以含1m nacl的结合缓冲液清洗树脂，洗去结合的杂蛋白，冲洗直至流出液电导稳定，即可进行下一次藻蓝蛋白粗提液纯化；
10、第三步、亲和树脂的彻底清洗；长期保藏亲和树脂前，用3m的硫氰化钾溶液以1ml/min的流速清洗树脂，彻底清洗结合在树脂上的蛋白，冲洗至蛋白检测基线(280nm吸光值)稳定，然后使用纯水冲洗树脂两到三个柱体积后用20％乙醇冲洗，4℃保藏。
11、本发明与现有技术相比的有益效果：
12、本发明提供了一种用于分离纯化藻蓝蛋白的亲和树脂配基和亲和树脂，利用本发明方法制备的亲和树脂和分离纯化方法仅通过一步层析即可将藻蓝蛋白粗提液分离纯化至分析纯级别。
1.熊果酸作为亲和树脂配基的应用，其特征在于，所述的应用为熊果酸作为分离纯化藻蓝蛋白亲和树脂的配基。
2.一种纯化藻蓝蛋白的亲和树脂，其特征在于，所述的亲和树脂由熊果酸的羧基与氨基树脂的氨基通过酰胺键共价连接而成。
3.权利要求2所述亲和树脂的制备方法，其特征在于，取小分子熊果酸溶于甲醇中，浓度不超过10mm，用甲醇清洗过的氨基树脂与熊果酸溶液按1：2的体积比混合，并向混合溶液中加入1-乙基(3-二甲氨基丙基)-3-碳二亚胺盐酸盐偶联剂粉末，避光过夜震荡，离心去除上清，用甲醇多次清洗沉淀，再以纯水清洗，之后用酸碱溶液多次交替清洗，获得亲和树脂，用20％乙醇溶液4℃保藏。
4.权利要求2所述亲和树脂的应用，其特征在于，所述的应用为利用权利要求2所述的亲和树脂分离纯化藻蓝蛋白。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应方法具体步骤如下：制备藻蓝蛋白粗提液，以ph为7.0的20mm磷酸二氢钠-磷酸氢二钠结合缓冲液流过亲和树脂层析柱，平衡两个以上柱体积，将藻蓝蛋白粗提液加到亲和树脂层析柱上，先以结合缓冲液冲洗，洗去无法结合的杂蛋白，待蛋白检测基线稳定，再加入含有50mm nacl的ph 4.0的20mm醋酸-醋酸钠的洗脱缓冲液，以1ml/min的流速洗脱，根据洗脱颜色变蓝或检测到620nm吸光值形成吸收峰，收集洗脱液；计算藻蓝蛋白收集液的620nm和280nm吸光值的比值，确定藻蓝蛋白的纯度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，收集藻蓝蛋白洗脱峰后，改用结合缓冲液冲洗亲和树脂至流出液ph为中性，以含1m nacl的结合缓冲液清洗树脂，洗去结合的杂蛋白，冲洗直至流出液电导稳定，即可进行下一次藻蓝蛋白粗提液纯化。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，长期保藏亲和树脂前，用3m的硫氰化钾溶液以1ml/min的流速清洗树脂，彻底清洗结合在树脂上的蛋白，冲洗至蛋白检测基线稳定，然后使用纯水冲洗树脂两到三个柱体积后用20％乙醇冲洗，4℃保藏。
