本发明属于细菌生物学检测，具体地，涉及利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法以及检测试剂盒。
背景技术：
1、志贺氏菌（shigella）为一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性杆菌，通常称为痢疾杆菌。人类对志贺氏菌普遍易感，志贺氏菌主要通过消化道传播引起感染，常伴随发热、腹痛、腹泻等症状。此外，志贺菌的感染可发生在任何年龄阶段，一年四季均可发生，尤其是学龄前儿童和青壮年相对其他年龄段人群发病率更高，严重危害人类健康。根据o抗原的不同，志贺氏菌可分为四个主要类群：痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌。
2、为了提高福氏志贺菌感染的防控效率和防控水平，首先需要对不同的感染源（如食品、水体等）中的福氏志贺菌进行有效检测，从而方便后续制备出更为科学的防控措施。目前，福氏志贺菌的主要检测方法有活菌分离培养法、定量逆转录pcr法及流式细胞分选技术等方法。
3、其中，活菌分离培养法是当前应用最广泛、最经典的微生物学检测技术之一，除了被应用于检测食品中的活菌数，它还常常被用于水质的检测。该方法在活菌培养后基于分离培养平板计数，是活菌检测的金标准，但耗时长，通常需要1-2天，且无菌操作对检测环境要求高。定量逆转录pcr（rt-qpcr）是一种用于检测基因转录情况的常见研究方法。在该方法中，信使rna（mrna）首先通过逆转录酶转录成互补dna（cdna）。随后，以cdna为模板进行qpcr反应。rt-qpcr法通过选取微生物特定基因的mrna作为检测靶标，虽然能够对样品中的活菌数目进行测定。然而，该方法前期必不可少的需要进行dna提取与扩增，因此步骤繁琐，成本较高，且需要精密的qpcr仪器与专业人员，无法实现偏远山区的现场检测。并且，该方法第一步通过裂解细菌提取核酸，因此无法指示活菌的状态。而在食品应用检测中，尽可能快速识别活菌是提高公共卫生事件解决效率的重要一步。此外，流式细胞分选技术是一种利用高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的现代细胞分析技术，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开，并可实现单克隆分选，从而对复杂样本中的细胞进行分类、定量和分离。然而，在实际应用中，流式细胞分选技术复杂昂贵，目前主要应用于科学研究，尚未普遍用于突发公共卫生事件及临床检验。
4、综上，上述现有技术或多或少的存在灵敏度低、成本高、耗时长、操作繁琐等缺点。因此，建立一种快速、稳定、高效、特异性高、价格低的检测技术，对福氏志贺菌的防治和临床用药都具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其工艺操作简单、成本低，且能够稳定灵敏的实现福氏志贺菌活菌的检测，解决现有技术中无法检测并有效指示出活的福氏志贺菌的问题。
2、本发明的目的之二是提供一种对福氏志贺菌活菌进行检测的试剂盒。
3、为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
4、利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，包括以下步骤：
5、（1）对待检测的样品进行预处理，得到待测菌液；所述待检测的样品为福氏志贺菌活菌的菌株或者含有福氏志贺菌活菌的待鉴别样本；
6、另准备杂交链；所述杂交链是通过适配体和阻断剂进行杂交制备得到；所述适配体的核苷酸序列如seq id no. 1所示；所述阻断剂的核苷酸序列如seq id no. 2所示；
7、（2）将步骤（1）中所述杂交链与待测菌液进行置换反应，得到置换反应产物；
8、（3）将步骤（2）所得置换反应产物作为检测物，将检测物加入到crispr/cas12a检测系统中混匀，然后进行荧光检测；荧光检测后，根据是否释放荧光信号，判断待检测的样品中是否含有福氏志贺菌活菌；或者根据释放的荧光信号强度，判断待检测的样品中福氏志贺菌活菌的含量；所述crispr/cas12a检测系统包括cas12a蛋白、双标记荧光探针、crrna、检测物；所述crrna的核苷酸序列如seq id no. 3所示。
9、其中，适配体的核苷酸序列（seq id no. 1）为：
10、ccggactagggctggttagcttcaatactgctgggcgagg；
11、阻断剂的核苷酸序列（seq id no. 2）为：
12、gctaaccagccctagtccgg；
13、crrna的核苷酸序列（seq id no. 3）为：
14、taatttctactaagtgtagatccggactagggctggttagc。
15、其中，上述适配体是本领域科研工作者筛选并验证得到的能够用于捕获福氏志贺菌的适配体。因此，能被该适配体捕获的福氏志贺菌及其相应样本，均适用于本发明的检测方法。seq id no. 3中，t代表尿嘧啶。seq id no. 1、seq id no. 3中加粗位点是适配体、crrna与阻断剂结合的位点。
16、优选地，所述待鉴别样本为食品、水样、土壤、排泄物、肠积液或呕吐物。
17、进一步优选地，所述待检测的样品为液体时，预处理是对待检测的样品进行离心，然后加细菌缓冲液悬浮，得到待测菌液；所述待检测的样品为固体时，所述预处理是在待检测的样品中加入细菌缓冲液洗涤，然后离心，重新加细菌缓冲液悬浮，得到待测菌液。
18、优选地，步骤（1）中，所述待测菌液中福氏志贺菌活菌的浓度≤2×108cfu/ml。
19、优选地，步骤（1）中，所述杂交是将适配体和阻断剂置于杂交缓冲液中，于85~105℃处理8~15min，然后室温孵育3~10h，得到杂交链。
20、优选地，步骤（2）中，所述置换反应是将杂交链和待测菌液混合后于室温下置换反应0.5~1h，然后离心，取上清液即得置换反应产物。
21、优选地，步骤（3）中，所述crispr/cas12a检测系统还包括水和cas12a反应缓冲液；所述双标记荧光探针为fam和bhq1双标记的dna荧光探针。其中fam为发光基团，bhq1为猝灭基团。也即所述双标记荧光探针的两端分别修饰有fam发光基团和bhq1猝灭基团。
22、进一步优选地，所述crispr/cas12a检测系统的组成为：8μl的水、3μl的cas12a反应缓冲液、7μl的双标记荧光探针、1.5μl的cas12a蛋白、1.5μl的crrna、5μl的检测物；其中，所述双标记荧光探针的浓度为2μm；所述cas12a蛋白的浓度为1μm；所述crrna的浓度为1μm。
23、本发明还提供一种对福氏志贺菌活菌进行检测的试剂盒，所述试剂盒包括杂交链、crrna、双标记荧光探针、cas12a蛋白，以及辅助试剂；所述杂交链是通过适配体和阻断剂进行杂交制备得到；所述适配体的核苷酸序列如seq id no. 1所示；所述阻断剂的核苷酸序列如seq id no. 2所示；所述crrna的核苷酸序列如seq id no. 3所示。
24、进一步优选地，所述试剂盒的使用方法，为利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法；所述辅助试剂为细菌缓冲液、cas12a反应缓冲液、水。进一步优选地，细菌缓冲液为tris-hcl缓冲液。
25、相较于现有技术，本发明的有益效果主要在于：
26、本发明提供的检测方法以及检测试剂盒，利用适配体与crispr/cas12a两大技术进行结合，从而实现活的福氏志贺菌的检测，其技术构思以及工艺原理可分为如下两个部分。
27、其一：适配体是一段核苷酸链，与福氏志贺菌靶标有高度的特异性与亲和性，可以作为识别部分。本发明首先选择高选择性的适配体，然后根据碱基互补配对原则设计阻断剂，二者杂交形成dna杂交双链。当存在细菌靶标（福氏志贺菌活菌）时，由于适配体与靶标之间的作用力远远大于碱基之间的互补配对作用力，所以适配体与细菌结合，杂交双链解离，阻断剂单链释放。
28、其二：crispr/cas12a技术作为信号方法技术，将释放的阻断剂作为crispr/cas12a的靶标链，cas12a蛋白在crrna的引导下与靶标链结合，激发cas12a的非特异性切割，不加选择地切割单链dna。此时，双标记荧光探针被切割后发生断裂，释放荧光。而根据释放的荧光情况以及荧光强度大小，可指示阻断剂的存在状态，进而指示菌的存在状态，由此判断是否含有福氏志贺菌活菌，以及活菌的含量高低。除此之外，由于细菌死亡后，适配体无法与结合，所以不再显示荧光。因此，本发明的该策略能够有效指示福氏志贺菌活菌的存在状态。
29、本发明提供的上述检测思路，一方面不需要进行菌种的dna提取，另一方面不需要进行靶基因的扩增，是一种直接识别和利用crispr信号放大进行活菌检测的技术。本发明中，先利用适配体的高亲和性，实现细菌检测的免提取与活菌检测，进一步在crispr/cas12a的放大下，实现在免扩增的条件下进行高选择性检测，检出限225cfu/ml左右，同时具有较高的灵敏度和特异度。并且，在进行样品检测时，仅通过置换反应和荧光检测过程即可实现活菌的检测，样本检测时间在1.5h小时左右，达到了最大程度上的缩减步骤、降低成本的目的。此外，整个检测过程不依赖于大型仪器与专业人员，只需要简单的离心机和荧光读板器即可得到结果，非常适合缺少先进设备与技术人员的偏远地区对于福氏志贺菌的现场检测需求。
30、进一步地，本发明采用的适配体和阻断剂作为dna单链，易于保存与储藏，适配体与抗体有相似的作用，可替代抗体完成检测，但抗体不稳定，且来源于动物，而适配体是dna单链，可以大批量生产，且稳定易保存，成本低。
31、并且，对于信号扩增部分，现有技术中，通常采用环状扩增、等温扩增或环介导等温扩增技术等实现靶标的检测，但扩增的步骤不仅会增加检测成本，且有假阳性的风险，还无法指示活菌的状态。而本发明首次采用crispr/cas12a技术与适配体技术进行有机结合，其不仅无需进行靶基因的扩增，省去了扩增操作，而且还能稳定灵敏的实现福氏志贺菌活菌的检测，极大的解决现有技术中无法检测并有效指示出活的福氏志贺菌的技术难题，在福氏志贺菌的检测方面极具应用潜力，并且也有助于解决福氏志贺菌所带来的食品安全以及公共卫生问题。
1.利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，所述待鉴别样本为食品、水样、土壤、排泄物、肠积液或呕吐物。
3.根据权利要求1所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，所述待检测的样品为液体时，预处理是对待检测的样品进行离心，然后加细菌缓冲液悬浮，得到待测菌液；所述待检测的样品为固体时，所述预处理是在待检测的样品中加入细菌缓冲液洗涤，然后离心，重新加细菌缓冲液悬浮，得到待测菌液。
4.根据权利要求1所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述待测菌液中福氏志贺菌活菌的浓度≤2×108cfu/ml。
5.根据权利要求1所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述杂交是将适配体和阻断剂置于杂交缓冲液中，于85~105℃处理8~15min，然后室温孵育3~10h，得到杂交链。
6.根据权利要求1~5任一项所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述置换反应是将杂交链和待测菌液混合后于室温下置换反应0.5~1h，然后离心，取上清液即得置换反应产物。
7.根据权利要求1~5任一项所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述crispr/cas12a检测系统还包括水和cas12a反应缓冲液；所述双标记荧光探针为fam和bhq1双标记的dna荧光探针。
8.根据权利要求7所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法，其特征在于，所述crispr/cas12a检测系统的组成为：8μl的水、3μl的cas12a反应缓冲液、7μl的双标记荧光探针、1.5μl的cas12a蛋白、1.5μl的crrna、5μl的检测物；其中，所述双标记荧光探针的浓度为2μm；所述cas12a蛋白的浓度为1μm；所述crrna的浓度为1μm。
9. 一种对福氏志贺菌活菌进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括杂交链、crrna、双标记荧光探针、cas12a蛋白，以及辅助试剂；所述杂交链是通过适配体和阻断剂进行杂交制备得到；所述适配体的核苷酸序列如seq id no. 1所示；所述阻断剂的核苷酸序列如seq id no. 2所示；所述crrna的核苷酸序列如seq id no. 3所示。
10.根据权利要求9所述的对福氏志贺菌活菌进行检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法，为如权利要求1所述的利用适配体和crispr/cas12a系统对福氏志贺菌活菌进行检测的方法；所述辅助试剂为细菌缓冲液、cas12a反应缓冲液、水。
