本发明涉及寄生虫病原体检测，具体涉及一种用于同时检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组及其应用，特别涉及一种基于荧光rpa技术的双重快速检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组及其应用。
背景技术：
1、棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球绦虫的中绦期幼虫(棘球蚴)寄生于中间宿主—人和动物的肝、肺、脾、肾等器官而引起的一种严重危害人类健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。该病广泛流行于全世界，给流行区当地农牧民带来了严重的经济损失和公共卫生问题。2012年，棘球蚴病被世界卫生组织(world health organization，who)列为17种被忽视的热带传染病(neglected tropical diseases，ntds)之一，也属于被忽视的人兽共患病(neglected zoonotic diseases，nzds)，更被当做全球早期预警系统优先预测和紧急处理的重大疾病之一。
2、目前，我国已经报道了5种棘球绦虫：细粒棘球绦虫(echinococcus granulosus，eg)、奥氏棘球绦虫(e.ortleppi)、加拿大棘球绦虫(e.canadensis)、多房棘球绦虫(e.multilocularis，em)和石渠棘球绦虫(e.shiquicus，es)。我国常见的棘球蚴病患者类型主要有细粒棘球蚴所致的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis，ce)和多房棘球蚴所致的泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis，ae)，偶有加拿大棘球绦虫和奥氏棘球绦虫中绦期幼虫感染人和家畜的报道，而石渠棘球绦虫中绦期幼虫主要感染野生动物。我国流行区人类棘球蚴病患病率调查表明，囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴病是所有棘球蚴病中，感染人数最多，危害最大的两种。两种类型棘球蚴病同域流行，且在流行区内存在囊型棘球蚴病和泡型棘球蚴病混合感染病例，这给当地居民的生命健康带来了极大的威胁。因此，建立一种准确的差异检测方法来区分和鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫对解决混合感染这一问题起着至关重要的作用。
3、直接通过形态学观察来进行棘球绦虫物种的鉴定，曾经是虫种鉴定最常用的方法之一，形态学的分析对于快速判断棘球绦虫所属的科、属和种等分类地位，起到了一定的向导作用。但因寄生宿主的个体差异、绦虫地理分布和生活环境的不同，会导致棘球绦虫同一个种及基因型虫体结构产生相应的改变，因此，仅仅依靠观察其形态结构的差异来鉴别和区分细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫很难得出准确的结论。免疫学方法同样经常被用于细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的鉴定，常用的有酶联免疫吸附试验(elisa)和免疫印迹法，通过抗原和抗体体外特异性免疫反应结果，来判定被检虫种或基因型。目前，市场上已经有用于检测细粒棘球绦虫的elisa试剂盒。由于免疫学试验灵敏性低、易产生假阳性，因此，免疫学试验检测以后还需要用分子生物学方法进一步验证。
4、多年来，国内外对于棘球绦虫的分子生物学检测方法主要包括核酸杂交法、pcr、多重巢式pcr、pcr-rflp法，以及环介导等温扩增技术(lamp)。尽管上述方法特异性和灵敏度都很高，但是它们操作相对复杂，耗时长，且需要训练有素的专业技术人员，有些方法(如lamp)还特别容易出现假阳性反应，因此这些方法的使用受到诸多因素的制约。
5、重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)是英国剑桥babraham研究院建立并由twist dx生物技术公司发明的。该技术以t4噬菌体的核酸复制机制为原理，反应所需原料有t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsx和uvsy、单链结合蛋白gp32、dna聚合酶以及寡聚核苷酸；同时还需要引物、探针、模板、ddh2o和mg2+等。该技术基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，模拟生物体内dna复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，摆脱了对热循环仪器的要求，可在短时间内快速扩增出目的片段，具有简便，快速，灵敏等优点。
6、目前，rpa技术已经用于石渠棘球绦虫和多房棘球绦虫的鉴定，但是未见rpa技术在细粒棘球绦虫检测中的应用，且先前建立的rpa检测技术，只能检测单一棘球绦虫感染，不适用于混合感染的检测。因此，基于rpa技术建立一种简便、快速、有效的双重快速检测和鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的方法，对于区分和鉴别细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫感染以及棘球蚴病的防控具有重要意义。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是如何简便、快速、有效的检测细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫。
2、第一方面，本发明要求保护用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组。
3、本发明要求保护的用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组由正向引物eg-rpa-f1、反向引物eg-rpa-r1和探针eg-rpa-p组成；
4、所述正向引物eg-rpa-f1为序列1所示的单链dna分子；
5、所述反向引物eg-rpa-r1为序列2所示的单链dna分子；
6、所述探针eg-rpa-p为序列3所示的单链dna分子。
7、上述引物探针组中，所述探针eg-rpa-p自5'末端起的第32位核苷酸标记荧光基团，且所述探针eg-rpa-p的第32位核苷酸与第33位核苷酸之间插入一个四氢呋喃，且所述探针eg-rpa-p的第34位核苷酸标记猝灭基团，且所述探针eg-rpa-p的3'末端修饰c3-spacer。
8、进一步的，所述荧光基团为荧光基团fam。所述猝灭基团为猝灭基团bhq1。
9、更进一步的，所述正向引物eg-rpa-f1、所述反向引物eg-rpa-r1和所述探针eg-rpa-p的摩尔比为7:7:2。
10、第二方面，本发明要求保护用于检测细粒棘球绦虫的试剂盒。
11、本发明要求保护的用于检测细粒棘球绦虫的试剂盒含有上述引物探针组；所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
12、a1)鉴定或辅助鉴定细粒棘球绦虫；
13、a2)检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫；
14、a3)区分或辅助区分细粒棘球绦虫与其他绦虫。
15、进一步的，所述试剂盒还可包括2×rehydration buffer和醋酸镁溶液(280mmol/l)。
16、更进一步的，所述试剂盒还可包括阴性对照(如无菌超纯水)和阳性对照(如细粒棘球绦虫的基因组dna)。
17、第三方面，本发明要求保护上述引物探针组或上述试剂盒的新用途。
18、本发明要求保护上述引物探针组或上述试剂盒在如下b1)-b6)中任一种：
19、b1)鉴定或辅助鉴定细粒棘球绦虫；
20、b2)检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫；
21、b3)区分或辅助区分细粒棘球绦虫与其他绦虫；
22、b4)制备鉴定或辅助鉴定细粒棘球绦虫的产品；
23、b5)制备检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫的产品；
24、b6)制备区分或辅助区分细粒棘球绦虫与其他绦虫的产品。
25、第四方面，本发明要求保护如下c1)-c3)任一种方法：
26、c1)一种鉴定或待测绦虫是否为细粒棘球绦虫的方法，包括如下步骤：以待测绦虫的基因组dna为模板，采用上述引物探针组进行rpa扩增，如果可以实现有效扩增，则待测绦虫为或候选为细粒棘球绦虫，如果不能实现有效扩增，则待测绦虫为或候选为非细粒棘球绦虫；
27、c2)一种检测或辅助检测待测样本中是否感染细粒棘球绦虫的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，采用上述引物探针组进行rpa扩增，如果可以实现有效扩增，则待测样本感染或候选感染细粒棘球绦虫，如果不能实现有效扩增，则待测样本未感染或候选为未感染细粒棘球绦虫；
28、c3)一种区分或辅助区分细粒棘球绦虫与其他绦虫的方法，包括如下步骤：以待测绦虫的基因组dna为模板，采用上述引物探针组进行rpa扩增，如果可以实现有效扩增，则待测绦虫为或候选为细粒棘球绦虫，如果不能实现有效扩增，则待测绦虫为或候选为其他绦虫。
29、上述c1)-c3)所述方法中，所述rpa扩增的反应体系具体如下：2×rehydrationbuffer29.5μl、正向引物eg-rpa-f1 2.1μl、反向引物eg-rpa-r1 2.1μl、探针eg-rpa-p 0.6μl、模板(基因组dna)1μl、ddh2o 12.2μl、醋酸镁溶液(280mmol/l)2.5μl。其中，所述正向引物eg-rpa-f1和所述反向引物eg-rpa-r1在反应体系中的终浓度均为0.42μmol/l，所述探针eg-rpa-p在反应体系中的终浓度为0.12μmol/l。
30、所述rpa扩增的反应条件具体如下：37-42℃反应8-22min，优选为38℃反应20min。
31、上述c1)-c3)所述方法中，具体通过检测荧光实现判断。
32、上述c1)-c3)所述方法中，所述其他绦虫为以犬科动物作为终末宿主的绦虫。
33、在本发明的一个具体实施方案中，所述以犬科动物作为终末宿主的绦虫为如下绦虫中的至少一种：多头带绦虫、泡状带绦虫、豆状带绦虫、多房棘球绦虫、石渠棘球绦虫、带状带绦虫、犬复孔绦虫、加拿大棘球绦虫g6基因型、加拿大棘球绦虫g10基因型和奥氏棘球绦虫。
34、上述c1)-c3)所述方法为非疾病诊断目的。
35、第五方面，本发明要求保护用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组。
36、本发明要求保护的用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组由上述用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组和用于检测多房棘球绦虫的引物探针组组成；
37、所述用于检测多房棘球绦虫的引物探针组由正向引物em-rpa-f、反向引物em-rpa-r和探针em-rpa-p组成；
38、所述正向引物em-rpa-f为序列4所示的单链dna分子；
39、所述反向引物em-rpa-r为序列5所示的单链dna分子；
40、所述探针em-rpa-p为序列6所示的单链dna分子。
41、上述成套引物探针组中，所述探针em-rpa-p自5'末端起的第31位核苷酸标记荧光基团，且所述探针em-rpa-p的第32位核苷酸与第33位核苷酸之间插入一个四氢呋喃，且所述探针em-rpa-p的第34位核苷酸标记猝灭基团，且所述探针em-rpa-p的3'末端修饰c3-spacer。
42、所述探针em-rpa-p标记的荧光基团与所述探针eg-rpa-p标记的荧光基团不同。
43、进一步的，所述荧光基团为荧光基团hex。所述猝灭基团为猝灭基团bhq2。
44、更进一步的，所述正向引物eg-rpa-f1、所述反向引物eg-rpa-r1、所述正向引物em-rpa-f、所述反向引物em-rpa-r、所述探针eg-rpa-p和所述探针em-rpa-p的摩尔比为10:10:10:10:3:3。
45、第六方面，本发明要求保护用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的试剂盒。
46、本发明要求保护的用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的试剂盒含有上述成套引物探针组；所述试剂盒的功能为如下x1)-x3)中任一种：
47、x1)检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫；
48、x2)筛查或辅助筛查感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主；
49、x3)防控或辅助防控囊型棘球蚴病和/或泡型棘球蚴病。
50、进一步的，所述试剂盒还可包括2×rehydration buffer和醋酸镁溶液(280mmol/l)。
51、更进一步的，所述试剂盒还可包括阴性对照(如无菌超纯水)和阳性对照(如细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的基因组dna)。
52、第七方面，本发明要求保护上述用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组或上述用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的试剂盒的新用途。
53、本发明要求保护上述用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组或上述用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的试剂盒在如下y1)-y6)中任一种：
54、y1)检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫；
55、y2)筛查或辅助筛查感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主；
56、y3)防控或辅助防控囊型棘球蚴病和/或泡型棘球蚴病；
57、y4)制备检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的产品；
58、y5)制备筛查或辅助筛查感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主的产品；
59、y6)制备防控或辅助防控囊型棘球蚴病和/或泡型棘球蚴病的产品。
60、第八方面，本发明要求保护如下z1)或z2)任一种方法：
61、z1)一种检测或辅助检测待测样本是否感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的方法，包括如下步骤：以待测样本的基因组dna为模板，采用上述成套引物探针组进行rpa扩增，如果可以实现有效扩增，则待测样本感染或候选感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫，如果不能实现有效扩增，则待测样本未感染或候选未感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫；
62、z2)一种筛查或辅助筛查感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主的方法，包括如下步骤：以待测患者或宿主(病变组织)的基因组dna为模板，采用上述成套引物探针组进行rpa扩增，如果可以实现有效扩增，则待测患者或宿主为或候选为感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主，如果不能实现有效扩增，则待测患者或宿主为非感染细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的患者或宿主。
63、上述z1)或z2)所述方法中，所述rpa扩增的反应体系具体如下：2×rehydrationbuffer 29.5μl、正向引物eg-rpa-f1 1μl、正向引物em-rpa-f 1μl、反向引物eg-rpa-r11μl、反向引物em-rpa-r 1μl、探针eg-rpa-p 0.6μl、探针em-rpa-p0.6μl、模板(基因组dna)2μl、ddh2o 10.8μl、醋酸镁溶液(280mmol/l)2.5μl。其中，所述正向引物eg-rpa-f1、所述反向引物eg-rpa-r1、所述正向引物em-rpa-f、所述反向引物em-rpa-r、所述探针eg-rpa-p和所述探针em-rpa-p在所述反应体系中的终浓度分别为0.4μmol/l、0.4μmol/l、0.4μmol/l、0.4μmol/l、0.12μmol/l、0.12μmol/l。
64、所述rpa扩增的反应条件具体如下：37-42℃反应8-22min，优选为38℃反应20min。
65、上述z1)或z2)所述方法中，可通过检测荧光实现判断。由于针对细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫设计的特异性探针标记的荧光基团不同，当扩增结果仅出现红色扩增曲线时，则待测样本仅感染或候选仅感染细粒棘球绦虫；当扩增结果仅出现蓝色扩增曲线时，则待测样本仅感染或候选仅感染多房棘球绦虫；当扩增结果同时出现红色和蓝色扩增曲线时，则待测样本同时感染或候选同时感染多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫。
66、上述z1)或z2)所述方法为非疾病诊断目的。
67、上述任一所述应用或试剂盒或方法中，所述待测绦虫可为待测绦虫的卵、幼虫和/或成虫。
68、上述任一所述应用或试剂盒或方法中，所述待测样本可为来自于细粒棘球绦虫和/或多房棘球绦虫的宿主动物的样本，如来源于中间宿主羊的包囊组织样本、来源于终末宿主犬科动物的粪便样本。
69、本发明首先基于荧光rpa技术设计了用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组，并筛选了最佳引物对，获得了用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组，接下来联合用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组和用于检测多房棘球绦虫的引物探针组，获得了可用于实时荧光rpa检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组，建立了基于荧光rpa技术的双重快速检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的方法，并对该方法进行了优化。通过实验证明：本发明提供的方法可以同时检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫两种病原，操作简便、快速，能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测，大大提高了检测效率，节约了检测时间及检测成本，且特异性强、灵敏度高(灵敏度可达10copies/μl dna样本)、实验重复性好，适用于现场高通量样品快速检测，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。
1.用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组，所述引物探针组由正向引物eg-rpa-f1、反向引物eg-rpa-r1和探针eg-rpa-p组成；
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：所述探针eg-rpa-p自5'末端起的第32位核苷酸标记荧光基团，且所述探针eg-rpa-p的第32位核苷酸与第33位核苷酸之间插入一个四氢呋喃，且所述探针eg-rpa-p的第34位核苷酸标记猝灭基团，且所述探针eg-rpa-p的3'末端修饰c3-spacer。
3.用于检测细粒棘球绦虫的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物探针组；所述试剂盒的功能为如下a1)-a3)中任一种：
4.权利要求1或2所述的引物探针组或权利要求3所述的试剂盒在如下b1)-b6)任一种中的应用：
5.如下c1)-c3)任一种方法：
6.用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的成套引物探针组，所述成套引物探针组由权利要求1或2所述的用于检测细粒棘球绦虫的引物探针组和用于检测多房棘球绦虫的引物探针组组成；
7.根据权利要求6所述的成套引物探针组，其特征在于：所述探针em-rpa-p自5'末端起的第31位核苷酸标记荧光基团，且所述探针em-rpa-p的第32位核苷酸与第33位核苷酸之间插入一个四氢呋喃，且所述探针em-rpa-p的第34位核苷酸标记猝灭基团，且所述探针em-rpa-p的3'末端修饰c3-spacer。
8.用于检测细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的试剂盒，所述试剂盒含有权利要求6或7所述的成套引物探针组；所述试剂盒的功能为如下x1)-x3)中任一种：
9.权利要求6或7所述的引物探针组或权利要求8所述的试剂盒在如下y1)-y6)任一种中的应用：
10.如下z1)或z2)任一种方法：
