本发明涉及一类新型检测nadh的荧光探针及其制备方法与生物应用，属于有机小分子荧光探针领域。
背景技术：
1、二氢烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)是维持细胞氧化还原稳态的重要辅酶。作为一种电子载体，nadh与氧化还原酶紧密相关，参与氧化还原酶催化代谢途径(如糖酵解，柠檬酸)中的重要氧化还原反应。最近，许多研究表明，nadh水平的改变可能反映了代谢通量的失调。例如，糖酵解异常导致的nadh含量水平升高。而且，越来越多的实验发现，nadh依赖的氧化还原酶的异常活性是各种代谢疾病的致病因素。因此，分析检测nadh的含量能够帮助人们了解有关疾病的进程并监测细胞对代谢调节药物治疗的反应。
2、近年来，目前已经报道了多种用于检测nadh的方法，例如电化学分析、高效液相色谱法、电泳法、酶法测定和荧光法等。传统的检测方式多是利用nadh本身在340nm处吸收峰的变化，其方式灵敏度低，特异差，且难以对活细胞内nadh值测定。在这些方法中，小分子荧光探针由于具有制备简单，使用方便，细胞渗透性高，毒性低以及适用于体内实验等优点，能够应用于许多生物学环境中而受到关注。荧光染料检测通常是依靠被检测物与荧光染料作用后荧光强度的增强或减弱来进行分析，因此染料的浓度，仪器的性能、环境等会影响最终荧光信号的输出结果。而氧杂蒽类荧光染料具有荧光量子产率高、生物相容性好和良好的稳定性等优点。使得氧杂蒽为骨架的荧光探针在荧光检测和识别方面发挥着重要的作用。
3、因此发明一种简单有效地荧光探针可以检测细胞内外源性nadh具有重要的意义。鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一类快速检测nadh的水溶性荧光探针及其制备方法，以解决传统氧杂蒽染料检测不灵敏、不准确，斯托克斯位移短以及难以对细胞内nadh含量动态监测等问题。
2、本发明采用的技术方案为：
3、一类用于检测nadh的荧光探针，该荧光探针结构如通式(i)所示：
4、
5、通式中：r1为n-甲基-喹啉-3-硼酸基团或n-甲基喹啉-6-硼酸基团或者h；r2为n-甲基-喹啉-3-硼酸基团或n-甲基喹啉-6-硼酸基团或者h；r3为苯环或者h；其中，r1、r2和r3的部分组合如下：
6、rh-qi1:r2＝h,r3＝ar rh-qi3:r1＝h,r3＝h
7、rh-qi2:r2＝h,r3＝ar rh-qi4:r1＝h,r3＝h
8、本发明同时提供了上述荧光探针的制备方法，其制备通式流程如下所示：
9、
10、具体制备步骤如下：
11、s1、将2-羟基-4-二乙氨基-2'-羧基二苯甲酮和间溴苯甲醚或4-溴-1-萘丙醇溶解在甲磺酸中，然后升温搅拌反应，得到中间体溴代罗丹明化合物；
12、s2、将溴代罗丹明化合物、6-喹啉硼酸或3-喹啉硼酸频哪酯在有机溶剂、碱性条件下，加入催化剂进行suzuki反应后，所得产物溶于有机溶剂，与碘甲烷进行甲基化反应，得到通式(i)所示的化合物或喹啉碘鎓盐。
13、作为本发明的一种实施方式，在s1中，所述缩合反应的时间为24～30小时，所述缩合反应的温度为90～100℃；
14、作为本发明的一种实施方式，化合物2-羟基-4-二乙氨基-2'-羧基二苯甲酮与间溴苯甲醚或4-溴-1-萘丙醇的摩尔比为1:1.1～1.5，优选1:1.1；如果化合物间溴苯甲醚或4-溴-1-萘丙醇的添加比例过大，则会增加反应成本，如果化合物间溴苯甲醚或4-溴-1-萘丙醇的添加比例过小，则反应时间会较长。
15、作为本发明的一种实施方式，化合物2-羟基-4-二乙氨基-2'-羧基二苯甲酮与间溴苯甲醚或4-溴-1-萘丙醇总重量与甲磺酸溶剂重量比为1:11～15，优选1:11；如果酸性溶剂添加的量过大，则会增加反应成本。如果酸性溶剂添加的量过小，则反应时间会过长。
16、作为本发明的一种实施方式，在s1中，所述s1中还包括减压蒸馏、酸碱中和和纯化的步骤，所述中和更优选采用碳酸氢钠，更易掌控。纯化用硅胶柱层析(展开剂为二氯甲烷:乙酸乙酯＝20/1,v:v)分离得到溴代罗丹明化合物。
17、作为本发明的一种实施方式，在s2中，所述suzuki反应的时间为20～48小时，所述suzuki反应的温度为90～110℃，所述suzuki反应中有机溶剂为甲苯和四氢呋喃；所述碱性条件为碳酸钠溶液；所述催化剂为四(三苯基膦)钯。
18、作为本发明的一种实施方式，溴代罗丹明化合物与6-喹啉硼酸或3-喹啉硼酸频哪酯的摩尔比为1:1.1；如果6-喹啉硼酸或3-喹啉硼酸频哪酯添加的量过大，则会增加反应成本。如果6-喹啉硼酸或3-喹啉硼酸频哪酯添加的量过小，则反应时间会过长。
19、作为本发明的一种实施方式，有机溶剂甲苯与四氢呋喃体积比为1:1；作为本发明的一种实施方式，溴代罗丹明化合物、6-喹啉硼酸或3-喹啉硼酸频哪酯的总量与碳酸钠重量比为1:1.5～1.8，优选为1:1.6；如果碳酸钠的添加比例过小，则ph值偏低，如果碳酸钠的添加比例过大，则ph值过高。作为本发明的一种实施方式，催化剂四(三苯基膦)钯与溴代罗丹明化合物的重量比为1:18～25，优选为1:20；如果催化剂添加的量过大，则会增加反应成本。如果催化剂添加的量过小，则反应时间会过长。
20、作为本发明的一种实施方式，在s2中，所述甲基化反应的时间为8～12小时，所述甲基化反应的温度为50～70℃；
21、作为本发明的一种实施方式，在s2中，suzuki反应的最终产物与碘甲烷的摩尔比为1:1.2～2；优选为1:1.5；如果碘甲烷添加的量过大，则会增加反应成本。如果碘甲烷添加的量过小，则产率会降低。
22、作为本发明的一种实施方式，在s2中还包括减压蒸馏和纯化的步骤，所述采用硅胶柱层析(展开剂为二氯甲烷:乙醇＝20/1,v:v)或用乙醚重结晶得到通式(i)所示的化合物。
23、本发明还提供了该类荧光探针与nadh的体外光谱响应以及生物应用：
24、1)探针荧光滴定光谱
25、将上述制得的荧光探针在二甲基亚砜(dmso)中制成5×10-3m的母液待用；
26、取3μl的5×10-3m的标准母体溶液于3ml检测体系中，配成浓度为5μm的主体溶液。向主体溶液中加入不同体积的客体溶液，使得样品瓶内nadh与探针的浓度比为梯度增加。摇匀后在37℃恒温箱平衡2h，测定其溶液的荧光强度。
27、2)探针的生物应用
28、将适当密度的hela细胞接种到6孔的培养皿中，在37℃含5％co2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，第一组：在hela细胞中加入探针共同培养半小时后，用pbs缓冲溶液清洗未进入细胞的探针分子，然后进行荧光成像；第二组：在hela细胞中加入探针和nadh共同培养半小时后，用pbs缓冲溶液清洗未进入细胞的探针分子，然后进行荧光成像；第三组在hela细胞中加入葡萄糖和探针各培养半小时后进行荧光成像。
29、上述该类荧光探针用于检测nadh的生物应用，该应用为在活的生物样品中检测nadh的浓度；活的生物样品包括活细胞或者活组织，优选为活的hela细胞。
30、本发明至少具有以下有益的效果：
31、本发明的荧光探针用于特异性识别nadh，本发明的探针在水溶液中的最大吸收波长在507nm附近，最大发射波长接近597nm，斯托克斯位移在90nm左右，远大于传统的罗丹明b(30nm)，对于消除成像时的干扰非常有效。
32、本发明的荧光探针通过suzuki反应将喹啉基团直接连接在氧杂蒽上，探针对nadh的识别通过破坏共轭体系导致荧光淬灭。并且这类探针对nadh响应具有较高灵敏度(检测限可达到1.9×10-5m，满足生物体内检测需求)，良好的光学稳定性(在激光连续照射30分钟的条件下，发光强度稳定)。而且本发明的探针具有良好的生物膜透性和较低的细胞毒性；可以实现细胞内外源性nadh的检测。
33、本发明提供的制备方法成本低，产率较高，经济技术效果明显。
1.一类用于检测nadh的荧光探针，其特征在于，该荧光探针如通式(i)所示：
2.权利要求1所述的一类用于检测nadh的荧光探针的制备方法，其制备通式流程如下所示：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在s1中，所述缩合反应的时间为24～30小时，所述缩合反应的温度为90～100℃；
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在s2中，所述suzuki反应的时间为20～48小时，反应温度为90～110℃；所述suzuki反应中有机溶剂为甲苯和四氢呋喃；所述碱性条件为碳酸钠溶液；所述催化剂为四(三苯基膦)钯；
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在s2中，所述甲基化反应的时间为8～12小时，温度为50～70℃；
6.权利要求1所述的一类用于检测nadh的荧光探针的应用，其特征在于，所述应用为检测活的生物样品中nadh的浓度。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述活的生物样品包括活细胞和活组织。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述活细胞优选为活的hela细胞。
