本发明属于化合物分析检测，具体涉及一种同时测定his、tmh和egt的方法。
背景技术：
1、麦角硫因(ergothioneine，简称egt)是一种特殊的硫代组氨酸甜菜碱的氨基酸，具有独特的氧化还原特性，且对植物和动物具有独特的生理作用，是天然的抗氧化剂和潜在的营养食品，在食品、化妆品和医药等行业具有巨大的应用前景。
2、麦角硫因的传统生物合成主要以平菇、猴头菇和榆黄菇等天然蘑菇发酵。目前研究出了较多酶法，以及化学-酶偶联方法用于制备麦角硫因。如先以组氨酸(his)为主底物，将其转化为组氨酸甜菜碱(tmh)，然后再利用组氨酸甜菜碱合成麦角硫因(egt)。在该反应中，为了监测反应进行的情况，需要对该反应体系中的主要活性成分组氨酸(his)、组氨酸甜菜碱(tmh)和麦角硫因(egt)进行检测。目前虽然有较多检测麦角硫因(egt)的方法，但检测组氨酸和组氨酸甜菜碱的方法较少，且不成熟，更没有能够同时对三种活性成分进行检测的方法。因检测过程繁琐，部分组分检测技术不成熟等问题，也对麦角硫因合成工艺的进一步发展和完善造成了一定的影响。因此，亟需提供一种能够同时测定his、tmh和egt的方法。
技术实现思路
1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够同时测定his、tmh和egt的方法。本发明提供的方法能够有效分离his、tmh、egt与杂质，并实现his、tmh和egt的定性、定量分析。
2、本发明提供了一种能够同时测定his、tmh和egt的方法。
3、具体地，一种能够同时测定his、tmh和egt的方法，包括以下步骤：
4、称取his、tmh、egt中的至少两种溶解于溶剂中，制得对照品溶液；
5、取待测样品溶液和所述对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，得到对照品和待测样品的色谱图；对比分析所述色谱图并判断所述待测样品中是否含有his、tmh、egt，或根据所述色谱图的峰面积计算所述待测样品中his、tmh或egt的含量；
6、在所述检测的过程中，采用流动相进行梯度洗脱，所述流动相包括流动相a和流动相b；所述流动相a包括0.03％～0.15％磷酸水溶液，所述流动相b包括0.03％～0.15％磷酸乙腈溶液；所述梯度洗脱的过程为：
7、0～1min，所述流动相a的体积百分比为3％～6％；
8、1～2min，所述流动相a的体积百分比由3％～6％升至58％～63％；
9、2～3min，所述流动相a的体积百分比由58％～63％降至41％～49％；
10、3～10min，所述流动相a的体积百分比由41％～49％降至32％～40％；
11、10～13min，所述流动相a的体积百分比保持32％～40％，或所述流动相a的体积百分比由32％～40％降至3％～10％。
12、优选地，所述溶剂为水或乙腈水溶液。所述乙腈水溶液中乙腈所占的体积百分比不大于75％，如50％乙腈水溶液。
13、优选地，在所述流动相中，所述流动相a包括0.05％～0.12％磷酸水溶液，所述流动相b包括0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液；进一步优选地，在所述流动相中，所述流动相a包括0.05％～0.10％磷酸水溶液，所述流动相b包括0.05％～0.10％磷酸乙腈溶液。需要理解的是，所述流动相a中0.05％～0.12％磷酸水溶液为磷酸的质量百分数为0.05％～0.12％；所述流动相b中0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液为磷酸的质量百分数为0.05％～0.12％。
14、优选地，所述梯度洗脱的过程为：
15、0～1min，所述流动相a的体积百分比为4％～6％；
16、1～2min，所述流动相a的体积百分比由4％～6％升至59％～62％；
17、2～3min，所述流动相a的体积百分比由59％～62％降至41％～45％；
18、3～10min，所述流动相a的体积百分比由41％～45％降至33％～40％；
19、10～13min，所述流动相a的体积百分比保持33％～40％，或所述流动相a的体积百分比由33％～40％降至3％～10％。
20、在10～13min，各物质均基本已出峰，保持所述流动相a的体积百分比不变或使所述流动相a的体积百分比逐步下降，均能使his、tmh、egt各物质与杂质实现良好分离。
21、需要说明的是，洗脱13min后还可以进一步延长洗脱时间，如在13～15min，控制所述流动相a的体积百分比由39％～40％降至4％～6％，以及在15～20min，控制所述流动相a的体积百分比保持5％等。因his、tmh、egt在13min前均能出峰，与杂质实现良好分离，洗脱时间的延长并不影响his、tmh、egt的检测。延长洗脱时间可以对色谱柱进行洗脱，有利于保护色谱柱。
22、进一步优选地，所述梯度洗脱的过程为：
23、0～1min，所述流动相a的体积百分比为4％～6％；
24、1～2min，所述流动相a的体积百分比由4％～6％升至60％；
25、2～3min，所述流动相a的体积百分比由60％降至42％～45％；
26、3～10min，所述流动相a的体积百分比由42％～45％降至35％～40％；
27、10～13min，所述流动相a的体积百分比保持35％～40％，或所述流动相a的体积百分比由35％～40％降至3％～10％。
28、更优选地，所述梯度洗脱的过程为：
29、0～1min，所述流动相a的体积百分比为4％～6％；
30、1～2min，所述流动相a的体积百分比由4％～6％升至60％；
31、2～3min，所述流动相a的体积百分比由60％降至42％～45％；
32、3～10min，所述流动相a的体积百分比由42％～45％降至38％～40％；
33、10～13min，所述流动相a的体积百分比保持38％～40％；
34、13～15min，所述流动相a的体积百分比由38％～40％降至4％～6％。
35、优选地，在所述检测的过程中，检测波长包括200～220nm；进一步优选地，所述检测波长包括205～215nm。在检测波长200～220nm下(尤其是205～215nm)，his、tmh、egt能够得到良好分离，实现定性分析；在此波长下his和tmh的峰形和分离度更优。
36、优选地，在所述检测的过程中，所述检测波长还包括250～275nm；进一步优先地，所述检测波长还包括255～265nm。在检测波长250～275nm下，egt有较好的峰形和分离度，且his和tmh在250～275nm下没有紫外吸收。选用200～220nm作为his和tmh的检测波长，250～275nm作为egt的检测波长，能够更好地避免三者的相互干扰，有利于同时对三种物质进行定量分析。
37、优选地，在所述检测的过程中，所述检测波长包括210nm和260nm。
38、优选地，在所述检测的过程中，采用两性离子键合硅胶色谱柱进行hplc分析；进一步优选地，所述两性离子键合硅胶色谱柱为ultimate hilic amphionⅱ(250x 4.6mm,5μm)。研究表明，c18和aq-c18色谱柱无法使his、tmh和egt实现良好分离，尤其是his和tmh在c18和aq-c18色谱柱均较快出峰，且两峰难以分离。
39、优选地，在所述检测的过程中，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～45℃，进样量为5～15μl。如在所述检测的过程中，所述流速为1.0ml/min，所述柱温为30℃，所述进样量为10μl。
40、相比现有技术，本发明的有益效果在于：
41、(1)本发明提供的方法，采用液相色谱进行检测，通过对流动相进行选择，对洗脱条件进行优化，能够有效分离his、tmh、egt与杂质，实现his、tmh和egt的定性、定量分析。该方法在保证分离度的情况下，能够改善峰形，获得更加准确的线性图谱和标准曲线，进而能够进行更为精确的浓度标定。该方法具有良好的精密度和重复性。
42、(2)本发明提供的方法，出峰时间短，检测时间缩短至13min，检测效率高，对麦角硫因合成方法的优化以及质量控制具有重要意义。
1.一种能够同时测定his、tmh和egt的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂为水或乙腈水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述流动相中，所述流动相a包括0.05％～0.12％磷酸水溶液，所述流动相b包括0.05％～0.12％磷酸乙腈溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述流动相中，所述流动相a包括0.05％～0.10％磷酸水溶液，所述流动相b包括0.05％～0.10％磷酸乙腈溶液。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的过程为：
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，检测波长包括200～220nm；优选地，所述检测波长包括205～215nm。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，所述检测波长还包括250～275nm；优先地，所述检测波长还包括255～265nm。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，采用两性离子键合硅胶色谱柱进行hplc分析。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述检测的过程中，流速为0.8～1.2ml/min，柱温为25～45℃，进样量为5～15μl。
