本发明属于基因生物工程，具体涉及基于绵羊全基因组crispr-cas9敲除文库筛选绵羊卵泡颗粒细胞fsh应答基因。
背景技术：
1、绵羊是重要的家畜之一，其繁殖性状直接影响着肉、毛产量和质量等重要经济性状。然而，传统的育种方法在改良绵羊繁殖性状方面存在一定的局限性。因此，研究绵羊繁殖性状的基因组学特征对于更深入了解其遗传机制和提高繁殖性状的效率具有重要意义。绵羊因其体型适宜、耐粗饲、妊娠期短，已成为农业领域的重要经济动物，同时也是制药和生物医学研究中重要的模式动物。
2、卵巢卵泡的发育主要受到垂体释放的卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone，fsh)和促黄体生成激素(luteinizing hormone，lh)调控，lh和fsh是通过血液循环传输到卵巢，lh作用于lhr受体，刺激卵泡膜细胞分泌雄激素，而fsh作用于颗粒细胞(granulosa cells，gcs)受体fshr，调节雄激素向雌激素转的化，从而使成熟卵泡所分泌的激素激增，导致lh浓度上升，促使卵泡破裂并释放成熟的卵母细胞，且fsh通过激活多个信号通路来调节细胞和组织的基因表达。fsh刺激下gcs中的基因表达非常复杂，需要激活许多转录因子并抑制转录抑制因子，fsh调节gcs中至少500个靶基因的表达，这些基因的表达驱动卵泡的发育，使其能够响应lh的激增，促进排卵、卵母细胞成熟和黄体形成，从而支持受精和着床后的胚胎发育。因此，fsh通过特定的基因表达程序调节卵泡发育，被广泛应用于辅助生殖技术中。
3、crispr/cas9是一种精确且高效的基因编辑工具，能够快速、广泛应用于研究基因功能并改善经济上重要的性状，如肌肉质量、纤维长度、毛色、脂肪颜色和窝产仔数等。crispr-cas9技术已成功地应用于绵羊、山羊和牛中，以引入各种不同类型的修饰，如基因敲除、多重基因敲除、基因敲入、dna寡核苷酸模板的点突变、碱基编辑器的单核苷酸改变。利用crispr-cas9介导的多重基因编辑，可以精确地同时靶向多个基因和多个性状，避免负的加性效应。全基因组范围的crispr-cas9基因敲除技术已应用到人类或小鼠等物种中，然而上述应用需提前构建cas9表达的稳定细胞系，操作过程复杂。目前尚未有针对绵羊的全基因组敲除文库，也未有将编码cas9酶基因与sgrna共同构建在同一载体敲除文库的相关记载。
技术实现思路
1、本发明提供了基于绵羊全基因组crispr-cas9敲除文库筛选绵羊卵泡颗粒细胞fsh应答基因，将编码cas9酶基因与sgrna共同构建在同一载体，通过对绵羊大量基因设计sgrna，构建出crispr-cas9敲除文库敲除绵羊卵泡颗粒细胞，从gcs敲除细胞中筛选出fsh应答基因。
2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
3、本发明提供了一种绵羊fsh应答基因敲除筛选文库，包括靶向fsh剂量依赖性基因的sgrna表达质粒，所述靶向fsh剂量依赖性基因包括znf367基因、clk1基因、prune2基因、tmem37基因、actg2基因、mb基因、adipor2基因、hk2基因、vdr基因、agpat2基因、eps8基因、foxo4基因、tsc22d3基因；靶向所述znf367基因、clk1基因、prune2基因、tmem37基因、actg2基因、mb基因、adipor2基因、hk2基因、vdr基因、agpat2基因、eps8基因、foxo4基因、tsc22d3基因的sgrna序列依次如seq id no.1-52所示，其中每个基因对应4条sgrna序列。
4、本发明还提供了一种绵羊fsh应答基因敲除筛选文库的构建方法，包括如下步骤：针对绵羊的2号染色体、3号染色体和x染色体基因设计并合成sgrna，将合成的sgrna用高保真酶进行扩增，回收扩增产物，将扩增产物与crispr_cas9慢病毒表达载体连接，连接后转化trans1-t1感受态细胞，提取质粒，获得靶向特异染色体sgrna表达质粒文库。
5、优选的，所述sgrna设计原则包括：sgrna长度设计为20nt且靶基因位点包含pam为ngg，靠近起始密码子atg，gc含量范围为40％～60％。
6、本发明还提供了一种绵羊卵泡颗粒敲除细胞的构建方法，包括如下步骤：将所述构建方法构建的sgrna表达质粒文库进行慢病毒包装，获得重组慢病毒；将重组慢病毒侵染绵羊卵泡颗粒细胞，含嘌呤霉素的培养基筛选培养6～8天，获得绵羊卵泡颗粒敲除细胞库。
7、优选的，所述绵羊卵泡颗粒细胞是从新鲜的绵羊卵巢组织中分离且培养传代至1～3代的细胞。
8、本发明还提供了一种筛选绵羊fsh应答基因的方法，包括如下步骤：将所述绵羊卵泡颗粒敲除细胞库用含5～15ng/mlfsh完全培养基培养，收集培养细胞；提取培养细胞的dna，pcr扩增，胶回收纯化，对纯化产物进行二代测序；将二代测序的数据与所述构建方法得到的sgrna表达质粒文库进行序列比对分析，sgrna富集数统计和标准化，筛选得到2号染色体、3号染色体和x染色体中共有499个被正向筛选的靶基因和337个被负向筛选的靶基因；用含不同浓度fsh培养基培养gcs，进行转录组测序；将上述获得的正向和负向筛选的836个基因与转录组测序数据进行stem分析，筛选出13个fsh剂量依赖性基因。
9、优选的，所述pcr扩增涉及的引物包括sgrna-f和sgrna-r，核苷酸序列如seq idno.53～54所示。
10、优选的，所述pcr扩增的反应体系包括：反应总体积为50μl，2x taq plus mastermix 25μl、sgrna-f 2μl、sgrna-r 2μl、基因组dna 4μl，补水至50μl。
11、优选的，所述pcr扩增的反应程序包括：95℃5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，72℃7min，40个循环，4℃∞。
12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
13、本发明首次提出了基于绵羊全基因组crispr-cas9敲除文库筛选绵羊卵泡颗粒细胞fsh应答基因，将编码cas9酶基因与sgrna共同构建在同一载体，通过全基因组crispr-cas9编辑技术敲除绵羊卵泡颗粒细胞，提取敲除细胞总基因组dna，通过pcr对sgrna信息进行分析，从2号染色体、3号染色体和x染色体中筛选出499个fsh的抗性靶基因，337个对fsh敏感靶基因。用含不同浓度fsh培养基培养gcs，进行转录组测序，将上述获得的正向和负向筛选的836个基因与转录组测序数据联合分析，筛选出13个fsh剂量依赖性基因。
14、本发明还首次提出了一种绵羊fsh应答基因敲除筛选文库，该文库包括靶向fsh剂量依赖性基因的sgrna表达质粒，其中靶向所述znf367基因、clk1基因、prune2基因、tmem37基因、actg2基因、mb基因、adipor2基因、hk2基因、vdr基因、agpat2基因、eps8基因、foxo4基因、tsc22d3基因的sgrna序列依次如seq id no.1-52所示，其中每个基因对应4条sgrna序列。
1.一种绵羊fsh应答基因敲除筛选文库，其特征在于，包括靶向fsh剂量依赖性基因的sgrna表达质粒，所述靶向fsh剂量依赖性基因包括znf367基因、clk1基因、prune2基因、tmem37基因、actg2基因、mb基因、adipor2基因、hk2基因、vdr基因、agpat2基因、eps8基因、foxo4基因、tsc22d3基因；
2.一种绵羊fsh应答基因敲除筛选文库的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：针对绵羊的2号染色体、3号染色体和x染色体基因设计并合成sgrna，将合成的sgrna用高保真酶进行扩增，回收扩增产物，将扩增产物与crispr_cas9慢病毒表达载体连接，连接后转化trans1-t1感受态细胞，提取质粒，获得靶向特异染色体sgrna表达质粒文库。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述sgrna设计原则包括：sgrna长度设计为20nt且靶基因位点包含pam为ngg，靠近起始密码子atg，gc含量范围为40％～60％。
4.一种绵羊卵泡颗粒敲除细胞的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2所述方法构建的sgrna表达质粒文库进行慢病毒包装，获得重组慢病毒；将重组慢病毒侵染绵羊卵泡颗粒细胞，含嘌呤霉素的培养基筛选培养6～8天后，获得绵羊卵泡颗粒敲除细胞库。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述绵羊卵泡颗粒细胞为从新鲜的绵羊卵巢组织中分离且培养传代至1～3代的细胞。
6.一种筛选绵羊fsh应答基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增涉及的引物包括sgrna-f和sgrna-r，核苷酸序列如seq id no.53～54所示。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应体系包括：反应总体积为50μl，2x taq plus master mix 25μl、sgrna-f 2μl、sgrna-r 2μl、基因组dna 4μl，补水至50μl。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的反应程序包括：95℃5min，95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，72℃7min，40个循环，4℃∞。
