本发明属于植物长距离系统性信号分析鉴定，具体涉及一种近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法。
背景技术：
1、维管系统是植物长期进化形成的一种有效的长距离运输系统，贯穿于整株植物的各个器官和组织中，木质部输导水分和无机盐，韧皮部则输导同化产物、植物激素、氨基酸等小分子物质和蛋白质、rna等大分子物质(lucas et al.,2013)。细胞壁是多细胞水平信息通讯的障碍，导致植物演化出了胞间连丝(plasmodesmata,pd)，从而形成相邻细胞间的通讯网络。胞间连丝贯穿植物表皮细胞外侧壁，将相邻细胞的细胞质膜、细胞质、内质网相互连接形成一种细胞间物质和信号分子交换的共质通道(sun et al.,2019和brunkard etal.,2017)，胞间连丝为mrna长距离运输提供高效转运路线。
2、目前，长距离移动的mrna鉴定主要采用生物信息学分析鉴定不同植物组织中外源遗传信息的累积情况。对于亲缘关系较远的物种，由于基因组序列差异大，可通过鉴定snps来区分长距离移动的转录本，以本氏烟草/番茄(接穗/砧木)嫁接为例，接穗至砧木长距离移动mrnas鉴定的生物信息流程，如图1所示(xia et al.,2014和xia et al.,2018)。对于两个亲缘关系较近的物种间移动mrnas则较难区分转录本，例如烤烟和雪茄烟，这两种烟草在植物学分类上均属于普通烟草栽培种(nicotiana tabacum l.)，属于异源多倍体，2n＝48，可能是林烟草(n.sylvestris)和绒毛状烟草(n.tomentosiformis)天然杂交的f1代自然加倍后形成的四倍体，遗传背景复杂。再者研究的材料与参考基因组测序材料不同，致使分析结果存在大量假阳性和部分假阴性(zhang et al.,2021)。基于已公开发表的移动mrna分析鉴定方法存在的问题。
技术实现思路
1、本发明解决现有技术较难区分两个亲缘关系较近的物种间移动mrnas转录本的问题，提供一种近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，构建不同生态型近缘物种嫁接后砧穗间移动mrnas分析流程，提高移动mrnas鉴定的准确性和真实性，为嫁接后长距离移动的系统性信号鉴定及分析提供方法依据。
2、本发明要求保护的技术方案如下：
3、一种近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，包括如下步骤：
4、s1：嫁接亲本材料的基因测序与组装：选择亲缘关系较近的两种物种的植株作为试验材料进行全基因组测序，然后将测得的序列进行拼接、组装，得到两种物种的参考基因组数据；
5、s2：嫁接构建根冠信号传递模式系统：将s1中所述两种物种的植株分别作为接穗或砧木，采用劈接法进行嫁接得到2个自根嫁接组合和2个同源嫁接组合，任取同源嫁接组合中的一种和2个自根嫁接组合进行移栽并培养得到3种嫁接体；所述嫁接体包括2种自根嫁接体和1种同源嫁接体；
6、s3：嫁接植株转录组测序和分析：分别对s2中得到的2种自根嫁接体的接穗和1种同源嫁接体的砧木和接穗进行样品采集，并对采集的样品进行总rna提取，并将提取的rna进行转录组测序分析得到2种自根嫁接体的接穗转录本以及1种同源嫁接体的砧木转录本和接穗转录本；并去除所有转录本中的低质量序列和错配序列；
7、s4：砧穗间长距离移动的mrna鉴定：通过将s3中同源嫁接体的接穗转录本或砧木转录本分别与s1中对应物种的参考基因组数据和s3中2种自根嫁接体的接穗转录本进行比对分析，经多次比对分析，去除自身背景和不表达的假阳性mrna，获得近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna；
8、s5：砧穗间长距离移动mrna序列优化：使用fpkm>0.05作为评估mrna移动的标准，去除s4得到的砧穗间长距离移动的mrna中fpkm小于0.05的序列，得到优化后的砧穗间长距离移动mrna。
9、优选地，s3中对2种自根嫁接体的接穗以及1种同源嫁接体的接穗和砧木分别进行处理，具体包括如下步骤：
10、s31：采集接穗或砧木的远端组织和近端组织得到一份样品，将样品用液氮速冻后存于-80℃冰箱；所述接穗的近端组织是指接合口往上5cm的茎秆，所述接穗的远距离组织是指接穗的顶叶及芽；所述砧木的近端组织是指接合口往下3cm的茎秆，所述砧木的远距离组织是指砧木的根系；
11、s32：采用植物总rna提取试剂盒对s31中的样品进行总rna提取得到rna样品；
12、s33：对s32中检测合格的rna样品送至测序公司进行文库构建和转录组深度测序，对测序得到的序列中的低质量序列进行剔除得到高质量转录本；去除高质量转录本中的碱基错配序列。
13、优选地，s33中通过如下方式检验rna样品是否合格：利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，nanodrop分光光度计检测rna浓度和纯度并进行质检，od260/280≥1.9表示rna提取合格。
14、优选地，s33中低质量的序列主要包括：含测序接头、带n或质量低的reads，长度低于40bp的序列；s33中去除高质量转录本中的碱基错配序列具体为：首先用bowtie2软件与核糖体rna数据库与高质量转录本做比对，比对条件为允许最多三个碱基错配；去除比对上rna数据库的reads，剩余的reads即为clean reads。
15、s4步骤中砧木至接穗长距离移动的mrna鉴定具体包括如下步骤：
16、s41：将同源嫁接体的接穗转录本分别与s1中两种物种的参考基因组数据进行比对，获得候选的移动mrna，表示为a；
17、s42：排除接穗本身自有的不表达的假阳性转录本，标记为b；
18、s43：排除砧木本身自有的不表达的假阳性转录本，标记为f；
19、s44：排除砧木向接穗移动的假阳性转录本，标记为f；
20、s45：砧木至接穗长距离移动mrna为候选的移动mrna减去假阳性的移动mrna，即a-b-f。
21、优选地，s41步骤具体包括：将同源嫁接体的接穗转录本首先与同源嫁接体的接穗对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，未比对上的转录本，进一步与同源嫁接体的砧木对应物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的序列为候选的移动mrna，表示为a。
22、优选地，s42步骤具体为：将同源嫁接体的接穗与接穗嫁接得到的自根嫁接体的接穗转录本与自根嫁接体的接穗对应s1中物种的参考基因组数据进行bowite2序列比对，将未比对上的序列进一步与s1中另一物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的即为接穗本身的转录本，标记为b。
23、优选地，s43步骤具体为：将同源嫁接体的接穗转录本首先与与同源嫁接体的砧木对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的序列进一步通过stringtie去除3个重复样本reads＝0的reads，即为假阳性的转录本，表示为f。
24、优选地，s44步骤具体为：将同源嫁接体的砧木与砧木嫁接得到的自根嫁接的接穗转录本与同源嫁接体的砧木对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，完全匹配的序列即为嫁接后砧木向接穗移动的转录本，标记为f。
25、优选地，接穗至砧木长距离移动的mrna鉴定方法与砧木至接穗移动的mrna分析方法一致，只是参考基因组数据比对存在差异。
26、有益效果：
27、本发明提供一种近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，对选择亲缘关系较近的两种物种的植株作为试验材料进行全基因组测序，然后将测得的序列进行拼接、组装，得到两种物种的参考基因组数据，将所述两种物种的植株分别作为接穗或砧木，采用劈接法进行嫁接得到2个自根嫁接组合和2个同源嫁接组合，任取同源嫁接组合中的一种和2个自根嫁接组合进行移栽并培养得到3种嫁接体，分别用自根和同源嫁接体的转录本与各自的参考基因组数据比对去除自身背景和不表达的假阳性mrna，保证两个亲缘关系较近的物种间移动mrnas鉴定的准确性和真实性，使用fpkm>0.05作为评估mrna移动的标准，去除移动mrna中fpkm小于0.05的序列，进一步提高了移动mrna分析的准确性；经试验测定，本发明提供的鉴定方法与常规的mrna分析鉴定方法相比，可减少833-1026个误差，可用于区分两个亲缘关系较近的物种间移动mrnas转录本，解决现有技术较难区分两个亲缘关系较近的物种间移动mrnas转录本的问题。
1.一种近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s3中对2种自根嫁接体的接穗以及1种同源嫁接体的接穗和砧木分别进行处理，具体包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s33中通过如下方式检验rna样品是否合格：利用琼脂糖凝胶电泳检测提取效果，nanodrop分光光度计检测rna浓度和纯度并进行质检，od260/280≥1.9表示rna提取合格。
4.根据权利要求3所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s33中低质量的序列主要包括：含测序接头、带n或质量低的reads，长度低于40bp的序列；s33中去除高质量转录本中的碱基错配序列具体为：首先用bowtie2软件与核糖体rna数据库与高质量转录本做比对，比对条件为允许最多三个碱基错配；去除比对上rna数据库的reads，剩余的reads即为clean reads。
5.根据权利要求4所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s4步骤中砧木至接穗长距离移动的mrna鉴定具体包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s41步骤具体包括：将同源嫁接体的接穗转录本首先与同源嫁接体的接穗对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，未比对上的转录本，进一步与同源嫁接体的砧木对应物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的序列为候选的移动mrna，表示为a。
7.根据权利要求6所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s42步骤具体为：将同源嫁接体的接穗与接穗嫁接得到的自根嫁接体的接穗转录本与自根嫁接体的接穗对应s1中物种的参考基因组数据进行bowite2序列比对，将未比对上的序列进一步与s1中另一物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的即为接穗本身的转录本，标记为b。
8.根据权利要求7所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s43步骤具体为：将同源嫁接体的接穗转录本首先与与同源嫁接体的砧木对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，比对上的序列进一步通过stringtie去除3个重复样本reads＝0的reads，即为假阳性的转录本，表示为f。
9.根据权利要求8所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，s44步骤具体为：将同源嫁接体的砧木与砧木嫁接得到的自根嫁接的接穗转录本与同源嫁接体的砧木对应s1中物种的参考基因组数据进行序列比对，完全匹配的序列即为嫁接后砧木向接穗移动的转录本，标记为f。
10.根据权利要求9所述的近缘物种嫁接后砧穗间长距离移动mrna鉴定方法，其特征在于，接穗至砧木长距离移动的mrna鉴定方法与砧木至接穗移动的mrna分析方法一致，只是参考基因组数据比对存在差异。
