本发明属于水稻病害防治，具体涉及水稻条斑病菌tale靶基因的鉴定方法、靶基因loc_os04g56040及其应用。
背景技术：
1、水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻对保证人们的日常生活所需及推动国民经济的发展有着极大的影响。我国水稻种植面积年均约为4.5亿亩，产量位居全球第一位，保障了稻米需求的自给自足和粮食安全。但是常见的各种水稻病害也威胁着水稻的生产，给粮食安全带来了严重的威胁。检疫性细菌病害如水稻细菌性条斑病属于种子生产和销售上一票否决的重要病害，严重威胁着杂交稻种生产和销售。因而，水稻病害检疫成为防治检疫性病害，保障粮食安全和种业健康的重要保障。
2、由细菌、真菌以及病毒等病原菌引起的病害给水稻的安全生产带来了极大的威胁。水稻黄单胞菌两个致病变种xanthomonas oryzaepv.oryzae(xoo)和xanthomonasoryzae pv.oryzicola(xoc)分别引起水稻白叶枯病和细菌性条斑病(简称条斑病)，是世界范围内广泛发生的两种主要水稻细菌性病害(-liu etal.,2006)。xoo和xoc都属于革兰氏阴性菌中的稻黄单胞致病变种，具有非常近缘的遗传关系(ke et al.,2017)。
3、条斑病在发现初期被认为是白叶枯病，后期才被鉴定为条斑病(zheng et al.,2005)。水稻条斑病最早于1918年在菲律宾被发现，后迅速传播至亚洲的热带和亚热带地区(ronald,1997)。1955年，我国首次在广东省发现该病害，随后在国内快速蔓延，现已成为我国南方稻区的主要病害之一，也是我国植物检疫的重要对象之一(zheng et al.,2005)。条斑病是仅次于稻瘟病、纹枯病、白叶枯病之后的第四大病害，可导致水稻减产15％-25％，严重情况下可减产40％-60％，给水稻的安全生产带来了严重的威胁(ju et al.,2017)。xoc通过气孔或伤口侵入，并在薄壁组织的细胞间隙定殖，形成水渍状的条状坏死(son etal.,2011)。在条斑病感染的早期，在叶脉之间可以观察到小的、水渍的病变，湿度大时叶片表面也会渗出黄色菌浓(-liu et al.,2006)。随着病斑不断扩展，可导致水稻叶片枯死(jiang et al.,2020)。带菌种子是该病主要的长距离传播途径，因此，它是杂交稻种生产重要的威胁之一(ju et al.,2017)。
4、基因组序列比较分析表明，条斑病菌含有i型至vi型蛋白分泌系统(büttner etal.,2009)。其中iii型分泌系统(type iii secretion system,t3ss)与xoc致病性密切相关，t3ss是由二十多种膜结构装置蛋白和转运蛋白组成的跨细菌内外膜、细胞外空隙和宿主细胞膜的环状中空管道，可以将iii型分泌效应因子(t3ss effector,t3se)传递到宿主细胞中(timilsina et al.,2020)。根据蛋白质结构和功能的不同，稻黄单胞菌中的t3se可以分类成两个家族，转录激活类效应因子(transcription activator-like effector,tale)和非转录激活类效应因子(non-transcription activator-like effector,non-tale)。tale是一类特殊的效应因子家族，它们可以激活宿主细胞核中的靶基因表达(kayet al.,2007)。tale具有高度保守的结构域，使其能够导入寄主植物细胞核并充当转录激活因子(kay et al.,2007；et al.,2007)。其具有由氨基末端iii型分泌信号、核定位信号(nuclear localization signals,nls)，以及羧基末端的酸性激活结构域(acidictranscriptional activation domain,ad)组成的模块化结构域(boch et al.,2010；bogdanove et al.,2010)。中心区域由几乎相同的重复序列串联而成，也称为中心重复区(central repeat region，crr)(scholze et al.,2011)。crr的数量在不同的tale之间变化，每个重复序列单元通常包含33-35个氨基酸，由称为重复可变二残基(repeat-variablediresidues,rvd)的第12和13位氨基酸决定与dna碱基的特异性相互作用(bogdanove et al.,2010)。
5、申请人前期分离鉴定了新的高致病性细菌性条斑病菌株hga4，相比我国常用菌株rs105的致病性更强。基因组测序揭示，hga4比rs105多携带4个tale效应分子(tal2b-tal2e)，它们可能是致病性更强的因素(wu et al.,2021)。当前tal2b、tal2c通过直接的ebe预测分别靶向水稻osf3h03g(sah1)、osf3h04g(sah2)，从而调控靶基因转录进而代谢修饰重要抗病激素小分子水杨酸参与致病性(wu et al.,2021；wu et al.,2022)。osf3h03g(sah1)、osf3h04g(sah2)启动子ebe元件双编辑的植株尽管提高对hga4的抗性，病斑长度显著减少，但相比rs105仍然具有更长的病斑，暗示tal2e仍可能也参与微效致病作用，参与hga4致病力的增强效应。然而，tal2e并未直接预测到靶基因，其是否有参与致病性的功能尚不清楚。
6、因此，有必要探究tal2e参与hga4强致病力的形成，并通过联合rna-seq技术鉴定其可能的靶基因，相关研究结果为全面解析hga4的强致病性以及利用基因工程技术培育水稻条斑病抗病品种具有指导意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于，提供水稻条斑病菌tale靶基因的鉴定方法、靶基因loc_os04g56040及其应用，为全面解析hga4的强致病性以及利用基因工程技术培育水稻条斑病抗病品种提供指导。
2、鉴于此，本发明的方案如下：本发明的第一个方面，提出水稻条斑病菌tale靶基因的鉴定方法，步骤包括：
3、s1.特异性上调表达差异基因的分析：
4、分别向水稻叶片接种低致病力菌株rs105、高致病力菌株hga4，结合未接种的叶片分析高致病力菌株hga4特异性上调表达差异基因；
5、基于低致病力菌株构建克隆有tal2e基因的菌株；分别向水稻叶片接种所述低致病力的菌株及克隆有tal2e基因的菌株，结合未接种的叶片分析tal2e特异性上调表达差异基因；
6、s2.将步骤s1所述tal2e特异性上调表达差异基因与高致病力菌株hga4的特异性上调表达差异基因进行联合分析，获得共同诱导上调表达的差异基因；再基于tal2e的关联性筛选得到靶基因loc_os04g56040。
7、进一步地，所述靶基因loc_os04g56040负调控水稻对条斑病的抗性；所述负调控表示loc_os04g56040基因的低表达对于水稻条斑病的抗性增强。
8、进一步地，所述tal2e基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9、进一步地，所述筛选过程为，先基于所述共同诱导上调表达的差异基因筛选被tal2e特异性诱导的基因，再验证筛选所得基因中是否存在结合tal2e的ebe元件。
10、本发明第二个方面提出，水稻loc_os04g56040基因作为靶点在防治水稻细菌性条斑病中的应用，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
11、本发明第三个方面提出，低表达水稻loc_os04g56040基因在增强水稻对细菌性条斑病抗性中的应用，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
12、进一步地，所述低表达水稻loc_os04g56040基因包括构建loc_os04g56040基因相关序列的抑制剂或阻断剂。
13、进一步地，所述低表达水稻loc_os04g56040基因为用于敲除基因loc_os04g56040或其相关序列的基因编辑载体。
14、本发明第四个方面提出，含有seq id no：2所示的loc_os04g56040基因低表达试剂在培育水稻品种中的应用，该水稻品种对细菌性条斑病菌抗性增强。优选地，所述应用为通过构建敲除基因loc_os04g56040或其相关序列的基因敲除突变体，获得稳定遗传的loc_os04g56040基因敲除编辑的水稻植株，从而获得增强水稻对细菌性条斑病抗性的水稻品种。
15、本发明第五个方面提出，水稻loc_os04g56040基因作为靶点在设计和筛选抗水稻细菌性条斑病药物中的应用，其特征在于，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seqid no：2所示。
16、与现有技术相比，本发明有益效果包括但不限于：
17、本发明通过将tal2e特异性上调表达差异基因与高致病力菌株hga4特异性上调表达差异基因进行联合分析筛选得到靶基因loc_os04g56040，该基因能够负调控水稻对条斑病的抗性，为全面解析hga4的强致病性以及利用基因工程技术培育水稻条斑病抗病品种提供指导。
1.水稻条斑病菌tale靶基因的鉴定方法，其特征在于，步骤包括：
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述靶基因loc_os04g56040负调控水稻对条斑病的抗性。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述tal2e基因的核苷酸序列如seqid no：1所示。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，步骤s4中，所述筛选过程为，先基于所述共同诱导上调表达的差异基因筛选被tal2e特异性诱导的基因，再验证筛选所得基因中是否存在结合tal2e的ebe元件。
5.水稻loc_os04g56040基因作为靶点在防治水稻细菌性条斑病中的应用，其特征在于，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
6.低表达水稻loc_os04g56040基因在增强水稻对细菌性条斑病抗性中的应用，其特征在于，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
7.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述低表达水稻loc_os04g56040基因包括构建loc_os04g56040基因相关序列的抑制剂或阻断剂。
8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述低表达水稻loc_os04g56040基因为用于敲除基因loc_os04g56040或其相关序列的基因编辑载体。
9.含有seq id no：2所示的loc_os04g56040基因低表达试剂在培育水稻品种中的应用，其特征在于，该水稻品种对细菌性条斑病菌抗性增强。
10.水稻loc_os04g56040基因作为靶点在设计和筛选抗水稻细菌性条斑病药物中的应用，其特征在于，所述loc_os04g56040基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。
