本技术属于细胞培养，具体涉及一种成纤维细胞培养基及其应用。
背景技术：
1、成纤维细胞是间充质起源的细胞，大量分布于结缔组织中。成纤维细胞可以合成、分泌胶原、蛋白纤维以及各种生长因子，构成了组织所需要的大多数细胞外基质，因此在伤口愈合中具有重要的作用。成纤维细胞具有高度的异质性，因此在不同器官，不同组织中分离的成纤维细胞具有不同的功能，比如心脏来源的心肌成纤维细胞可以修复心脏损伤，抑制炎症以及调节免疫反应，被用于心脏病的治疗；真皮来源的成纤维细胞可以通过分泌细胞外基质，修复皮肤损伤和美化皮肤，因此具有皮肤烧伤的修复和美容的效果；滑膜来源的成纤维细胞可以治疗类风湿关节炎；口腔黏膜来源的成纤维细胞可以修复口腔黏膜以及牙龈骨质等等。鉴于成纤维细胞具有修复损伤和调节免疫的能力，被越来越多的科研人员所研究用于各种疾病的治疗。
2、在成纤维细胞用于治疗疾病时，治疗单个病人所需要的成纤维细胞数较大。目前对于成纤维细胞的培养多采用有酚红基础培养基+胎牛血清来培养，这违背了细胞药物工艺开发中外源基因禁止进入人体的原则。并且，传统培养方法因传代次数有限，增殖速度慢，造成商业化过程培养成本较大。
3、因此亟需寻找一种血清替代物培养基，通过优化成纤维细胞培养工艺，降低培养成本，更快推进成药进程。
技术实现思路
1、1.要解决的问题
2、本技术针对目前成纤维细胞培养基中存在外源基因引起的基因污染风险问题，提供一种成纤维细胞培养基及其应用，该成纤维细胞培养基包括mccoy’s 5a基础培养基、人血小板裂解物(hpl)、氢化可的松和/或转化生长因子β1(tgf-β1)，避免了外源基因的引入，用于成纤维细胞培养，能够克服现有酚红dmem+10％胎牛血清培养成纤维细胞时传代代次有限、增殖速度慢的问题，能够实现成纤维细胞的大规模扩增和/或成纤维细胞功能的增强。此外，本技术的培养基能够用于在低氧条件下培养成纤维细胞，克服现有常氧条件培养成纤维细胞的培养方式单一、培养的成纤维细胞无法适应多样复杂的病例的问题，培养的成纤维能够适应低氧环境，能够更好的满足成纤维细胞在不同病例场景，尤其是低氧环境(如椎间盘)中的应用。
3、2.技术方案
4、为了解决上述问题，本技术所采用的技术方案如下：
5、本技术提供了一种成纤维细胞培养基，该培养基包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物(hpl)，人血小板裂解物(hpl)的浓度为5％～10％(v/v)，其中人血小板裂解物(hpl)可以替代胎牛血清，从而避免外源基因的引入。
6、进一步地，上述人血小板裂解物(hpl)的浓度为5％、7.5％或10％。
7、进一步地，上述人血小板裂解物(hpl)的浓度为7.5％，申请人研究发现人血小板裂解物(hpl)的浓度并非越高越好，高于7.5％(如10％)，培养成纤维细胞时，成纤维细胞的增殖能力减弱。
8、进一步地，上述一种成纤维细胞培养基，包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物(hpl)，还包括：氢化可的松，氢化可的松的浓度为5～15μg/ml，添加氢化可的松的培养基可增强成纤维细胞的增殖能力。更进一步地，氢化可的松的浓度为10μg/ml。
9、进一步地，上述一种成纤维细胞培养基，包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物(hpl)，还包括：tgf-β1，tgf-β1的浓度为10～30ng/ml，添加tgf-β1的培养基培养的成纤维细胞功能属性标志物col1a1、fibronectin、tgf-β1、desmin、vimentin、fsp1表达增加，功能更强。更进一步地，tgf-β1的浓度为20ng/ml。
10、进一步地，上述一种成纤维细胞培养基，包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物(hpl)，还包括：氢化可的松和tgf-β1，氢化可的松的浓度为5～15μg/ml，tgf-β1的浓度为10～30ng/ml，添加了氢化可的松和tgf-β1，成纤维细胞的传代极限更长，可实现成纤维细胞的大规模培养；同时培养的成纤维细胞功能更强。更进一步地，氢化可的松的浓度为10μg/ml，tgf-β1的浓度为20ng/ml。
11、本技术还提供了上述一种成纤维细胞培养基在成纤维细胞培养中的应用。
12、进一步地，上述应用包括：以37℃，5％ co2的常氧条件为培养环境。
13、进一步地，上述应用包括：以37℃，1％ o2的低氧条件为培养环境，成纤维细胞在低氧环境下，增殖速度和功能属性都能得到增强，在该培养体系下，成纤维细胞至少可传代50代，且成纤维细胞功能属性至少增强2～3倍。
14、本技术还提供了一种成纤维细胞的培养方法，包括：将成纤维细胞接种于上述任一成纤维细胞培养基，以37℃，5％ co2的常氧条件为培养环境，培养成纤维细胞。
15、本技术还提供了一种成纤维细胞的培养方法，包括：将成纤维细胞接种于上述任一成纤维细胞培养基，以37℃，1％ o2的低氧条件为培养环境，培养成纤维细胞。
16、本技术还提供了上述成纤维细胞的培养方法培养的成纤维细胞。
17、本技术还提供了上述成纤维细胞的培养方法培养的成纤维细胞在制备修复心脏损伤、修复皮肤损伤、治疗类风湿关节炎、修复口腔黏膜以及牙龈骨质或治疗椎间盘损伤等药物中的应用。
18、3.有益效果
19、本技术与现有技术相比，其有益效果在于：
20、(1)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物(hpl)，人血小板裂解物(hpl)可以替代胎牛血清，从而避免外源基因的引入。
21、(2)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，包括mccoy’s 5a基础培养基、人血小板裂解物(hpl)和氢化可的松，添加氢化可的松的培养基可增强成纤维细胞的增殖能力。
22、(3)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，包括mccoy’s 5a基础培养基、人血小板裂解物(hpl)和tgf-β1，添加tgf-β1的培养基培养的成纤维细胞功能属性标志物col1a1、fibronectin、tgf-β1、desmin、vimentin、fsp1表达增加，功能更强。
23、(4)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，包括mccoy’s 5a基础培养基、人血小板裂解物(hpl)、氢化可的松和tgf-β1，可同时增强成纤维细胞的增殖能力和培养的成纤维细胞的功能。
24、(5)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，用于成纤维细胞的培养，在常氧条件下(37℃，5％ co2)，实现成纤维细胞在体外的大量扩增，传代代次达到50代，实现成纤维细胞在体外的大量扩增。
25、(6)本技术提供的一种成纤维细胞培养基及其应用，用于成纤维细胞的培养，在低氧条件下(37℃，1％ o2)，与常氧条件相比，传代代次更多(超过50代)，成纤维细胞的功能属性增强2～3倍，实现成纤维细胞在体外的大量扩增。并且培养的成纤维能够适应低氧环境，能够更好的满足成纤维细胞在不同病例场景，尤其是低氧环境(如椎间盘)中的应用。
1.一种成纤维细胞培养基，其特征在于，所述培养基包括mccoy’s 5a基础培养基和人血小板裂解物，所述人血小板裂解物的浓度为5％～10％(v/v)。
2.根据权利要求1所述的一种成纤维细胞培养基，其特征在于，所述人血小板裂解物的浓度为5％、7.5％或10％。
3.根据权利要求1或2所述的一种成纤维细胞培养基，其特征在于，所述培养基还包括氢化可的松和/或tgf-β1。
4.根据权利要求3所述的一种成纤维细胞培养基，其特征在于，所述氢化可的松的浓度为5～15μg/ml，所述tgf-β1的浓度为10～30ng/ml。
5.权利要求1-4任一所述的一种成纤维细胞培养基在培养成纤维细胞中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用以37℃，5％co2的常氧条件为培养环境；或所述应用以37℃，1％o2的低氧条件为培养环境。
7.一种成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括：将成纤维细胞接种于权利要求1-4任一所述的一种成纤维细胞培养基，以37℃，5％co2的常氧条件为培养环境，培养成纤维细胞。
8.一种成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括：将成纤维细胞接种于权利要求1-9任一所述的一种成纤维细胞培养基，以37℃，1％o2的低氧条件为培养环境，培养成纤维细胞。
9.权利要求7或8所述的一种成纤维细胞的培养方法培养的成纤维细胞。
10.权利要求9所述的成纤维细胞在制备修复心脏损伤、修复皮肤损伤、治疗类风湿关节炎、修复口腔黏膜以及牙龈骨质或治疗椎间盘损伤药物中的应用。
