本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种中华绒螯蟹dna指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术：
1、中华绒螯蟹(eriocheir sinensis)隶属于十足目(decapoda)、弓蟹科(varunidae)、绒螯蟹属(eriocheir)，又名河蟹和大闸蟹等，主要分布于我国长江和辽河等水域，是重要的水产养殖经济品种。由于过度捕捞、水环境恶化和生境破坏等因素导致中华绒螯蟹资源衰退。因此，从不同水系无序引种和盲目放苗的现象愈发频繁，这不可避免地导致河蟹种质资源退化，产量和品质下降，严重制约了河蟹产业的绿色发展。加之，我国中华绒螯蟹养殖规模不断扩大，种业保护措施和养殖管理不规范等问题日益凸显。此外，在养殖和运输过程中极易出现河蟹逃逸现象，这都加剧了种质资源的混杂。因此，急需一种能够精确鉴别不同品种中华绒螯蟹的方法，对后续种质资源鉴定和遗传多样性研究尤为重要。
2、利用高多态性snp位点构建的dna指纹图谱，具有多态性强、不易受环境条件和主观因素的影响、能更加精准的鉴别不同品种遗传信息等特点。dna指纹图谱在品种种质资源鉴定和遗传多样性上应用前景广泛，但尚未应用于中华绒螯蟹种质资源鉴定的研究。
3、目前中华绒螯蟹品种鉴定技术中主要存在的问题：1、现有鉴别品种的方法主要使用rflp、issr和ssr等分子标记，所需实验周期长，精确度低。2、现有利用头胸甲等形态特征对中华绒螯蟹种质资源进行鉴定，受人为因素和环境条件影响较大。3、现有技术中利用脂肪酸等营养成分组成和含量区分不同地理来源的中华绒螯蟹，无法排除饲料组成和养殖环境等对中华绒螯蟹营养成分组成的影响，无法从遗传本质上鉴别种质资源。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种中华绒螯蟹dna指纹图谱，利用该dna指纹图谱可以快速、高效和准确的鉴定中华绒螯蟹不同水域的种质资源。本发明首次提出了用于鉴定中华绒螯蟹dna指纹图谱并且准确度高。
2、本发明还提供所述中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法和应用。
3、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述中华绒螯蟹dna指纹图谱，所述dna指纹图谱均包括78个snp位点，所述snp位点及特异性核苷酸如下：
4、 序号 染色体 位置 核苷酸 序号 染色体 位置 核苷酸 1 chr1 99217 t/c 40 chr32 2328181 a/t 2 chr1 38720448 g/a 41 chr33 161249 c/a 3 chr2 405837 g/a 42 chr34 1666626 a/g 4 chr2 25617819 g/a 43 chr35 567310 t/g 5 chr3 70473 a/g 44 chr36 672423 g/a 6 chr3 25107852 t/c 45 chr37 424371 a/c 7 chr4 1558939 c/t 46 chr38 323667 a/g 8 chr4 26621963 c/t 47 chr39 135012 a/t 9 chr5 584213 g/a 48 chr40 53631 c/a 10 chr5 25646473 t/c 49 chr41 131332 a/t 11 chr6 215261 g/c 50 chr42 193854 c/t 12 chr6 25243217 t/c 51 chr43 2957 c/t 13 chr7 128231 c/t 52 chr44 374945 a/g 14 chr7 25130734 a/g 53 chr45 841188 t/c 15 chr8 499625 g/a 54 chr46 142856 c/t 16 chr9 486990 a/g 55 chr47 162792 g/a 17 chr9 25518156 g/a 56 chr48 61003 g/a 18 chr10 292307 a/g 57 chr49 243340 t/g 19 chr11 793246 a/t 58 chr50 166519 c/t 20 chr12 145168 c/g 59 chr51 23060 t/a 21 chr13 1008227 t/g 60 chr52 55932 g/a 22 chr14 54272 a/g 61 chr53 2239866 t/a 23 chr15 179693 a/g 62 chr54 14560 a/g 24 chr16 2699367 g/a 63 chr55 23007 g/a 25 chr17 73954 c/g 64 chr56 189487 g/a 26 chr18 192820 t/c 65 chr57 254078 c/t 27 chr19 116958 g/c 66 chr58 65370 t/a 28 chr20 282617 a/t 67 chr59 157051 a/g 29 chr21 419905 t/g 68 chr60 86713 c/t 30 chr22 769751 c/t 69 chr61 587207 a/g 31 chr23 11879 g/t 70 chr62 10220 g/c 32 chr24 22105 a/c 71 chr63 390533 c/t 33 chr25 4578 t/g 72 chr64 278579 t/a 34 chr26 118662 c/t 73 chr65 546629 c/a 35 chr27 688832 c/t 74 chr66 108002 g/c 36 chr28 45286 g/a 75 chr67 114412 a/g 37 chr29 1000395 a/g 76 chr68 15155 t/c 38 chr30 72370 c/t 77 chr69 1028650 a/g 39 chr31 41525 g/a 78 chr70 962197 a/g
5、。
6、本发明所述中华绒螯蟹dna指纹图谱，包括长江水域中华绒螯蟹dna指纹图谱和辽河水域中华绒螯蟹dna指纹图谱，两种dna指纹图谱均包括78个snp位点，所述长江水域中华绒螯蟹dna指纹图谱的snp位点及特异性核苷酸如下：
7、
8、
9、所述辽河水域中华绒螯蟹dna指纹图谱的snp位点及特异性核苷酸如下：
10、
11、
12、本发明所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
13、(1)采集长江水域和辽河水域的中华绒螯蟹；
14、(2)提取中华绒螯蟹肌肉组织的dna；
15、(3)质控合格的dna片段上机进行重测序；
16、(4)得到的测序数据进行过滤、测序数据污染检测和测序数据质量评估；
17、(5)采用sentieon软件将各个样本的readss比对到参考基因组上并进行变异检测，构建中华绒螯蟹的特异性snp位点数据库；
18、(6)根据缺少率、maf值、单拷贝、位点杂合度和深度进一步过滤，筛选高多态性snp位点，用于构建dna指纹图谱。
19、其中，步骤(3)所述质控合格的dna片段上机重测序具体步骤为：将dna样品进行酶切片段化，用连接酶将测序接头与片段化dna链接在一起，对连接产物进行pcr扩增，用磁珠对pcr产物进行片段筛选；然后，将线性文库变性为单链后进行环化，形成单链环状文库，经过滚环复制形成dna纳米球(dnb)，最后，利用加载设备mgidl-t7将dnb加载到测序芯片中，通过联合探针锚定聚合技术上机进行重测序。
20、其中，步骤(4)中得到的测序数据进行过滤、测序数据污染检测和测序数据质量评估包括测序数据和质量指标汇总、测序数据碱基含量、测序数据污染检测。其中，步骤(5)中参考基因组为ncbi上的txid95602中华绒螯蟹全基因组。其中，步骤(5)中经过变异检测，获得每个样本的gvcf，使用sentieon进行joint-calling，对所有样本的gvcf进行联合分析，得到每个个体的变异结果。联合分析后得到的snp位点进行初步过滤(snp硬过滤标准：qd＜2.0||fs＞60.0||mq＜40.0||sor＞3.0||mqranksum＜-12.5||readposranksum＜-8.0)，得到中华绒螯蟹的特异性snp位点数据库。
21、其中，步骤(6)中筛选标准为缺失率为0；maf值≥0.1；提取位点上下游100bp的序列进行拷贝数分析，保留上下游序列在基因组上是唯一的位点；位点杂合率<0.15和位点深度>10进一步过滤。
22、本发明所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱在鉴定中华绒螯蟹不同水域的种质资源中的应用。
23、其中，所述应用的过程为：
24、(1)对待测中华绒螯蟹样本提取dna及重测序；
25、(2)对测试数据进行质控，根据snp硬过滤标准进行初步过滤，然后，根据缺失率、maf值、单拷贝、位点杂合度和深度进一步过滤，最后按照>10mb的间隔和在染色体上均匀分布筛选位点，最终得到能够完全分开所有样品的snp位点；
26、(3)对筛选后的高多态性snp位点，使用plink软件计算样本间遗传距离和构建系统发育树；
27、(4)将筛选到的snp位点与不同水域中华绒螯蟹的dna指纹图谱进行比对，符合率≥95％时，确定待测样品为中华绒螯蟹群体，对高多态性snp位点的基因型进行聚类分析，根据系统进化树的聚类情况，可判断未知水域中华绒螯蟹属于辽河水域群体或长江水域群体。
28、作为优选，所述步骤(1)中待测中华绒螯蟹样本为肌肉组织；所述中华绒螯蟹群体分别于长江水域和辽河水域随机捕捞。
29、其中，步骤(3)和(4)通过计算各样本间的遗传距离，比较亲缘关系的远近，进行群体聚类分析，鉴定为长江水域群体或辽河水域群体。
30、中华绒螯蟹主要分布于长江水域和辽河水域，该地区河蟹种质资源丰富，能够为后续培育新品种提供优质的育种材料。因此，本发明根据长江水域和辽河水域中华绒螯蟹的特异性snp位点组合构建dna指纹图谱。本发明提供了一种全新的中华绒螯蟹dna指纹图谱本发明通过对长江水域和辽河水域共46份中华绒螯蟹样品进行重测序和位点筛选后，得到78个可用于中华绒螯蟹种质资源鉴定的高特异性snp位点构建成中华绒螯蟹dna指纹图谱。本发明利用中华绒螯蟹dna指纹图谱可以快速且精准的鉴定长江水域和辽河水域群体。本发明利用snp位点信息构建dna指纹图谱，为中华绒螯蟹品种鉴定、群体来源和分子辅助育种等方面提供更有效、更精确的方法。
31、本发明首次利用高多态性snp位点构建中华绒螯蟹dna指纹图谱。本发明利用snp位点从遗传水平鉴别不同水域中华绒螯蟹，避免了通过形态特征、营养成分等指标进行水域鉴别时，受各种因素导致的误差。此外，因为snp位点具有多态性、分布广和稳定性高等优点，相较利用其他分子标记构建的dna指纹图谱，本发明的鉴定结果更具准确性。基于本发明构建的dna指纹图谱，对未知水域的中华绒螯蟹无需进行全部snp位点检测，只需要选取本发明筛选到的78个高多态性snp进行基因型的聚类分析，即可鉴别出未知水域的中华绒螯蟹属于辽河水域还是长江水域。不同分子标记间的特征和优势已进行细致的对比，第一代分子标记以rflp为代表，其成本高，实验步骤多，周期长以及标记稳定性较差。第二代分子标记微卫星标记，不能直接从dna数据库查寻，则首先必须对其进行测序，再设计引物，开发成本高。本发明选择利用snp分子标记构建dna指纹图谱，在所有生物的基因组中含量丰富，突变率较低，且获取的成本低。
32、有益效果：本发明与现有技术相比，其显著优点是：
33、1、本发明首次提出通过全基因组重测序技术获得特异性snp分子标记构建中华绒螯蟹dna指纹图谱及不同水域中华绒螯蟹的鉴定方法。
34、2、第三代分子标记snp具有数量多，在基因组上分布广泛均匀；稳定性高；适于快速、规模化筛查等优点，本发明利用snp分子标记构建dna指纹图谱，打破了利用rflp、issr和ssr等第一代和第二代分子标记进行种子资源鉴定的测序时间长、价格高和测序通量较小等缺陷。
35、3、本发明基于中华绒螯蟹全基因组重测序获得的高多态性snp绘制指纹图谱，通过计算样本间的遗传距离，从遗传层面精确的鉴别不同品种的中华绒螯蟹，避免了通过形态特征、营养成分含量等方法进行品种鉴别时，因主观因素和环境条件等对分类结果的影响。
36、4、对高多态性snp位点进行基因型转换，可以制作成中华绒螯蟹snp分子身份证，对中华绒螯蟹进行品种鉴定时仅需要利用dna指纹图谱对应snp位点的基因型进行聚类分析，即可快速进行品种分类。
1.一种中华绒螯蟹dna指纹图谱，其特征在于，所述dna指纹图谱均包括78个snp位点，所述snp位点及特异性核苷酸如下：
2.一种中华绒螯蟹dna指纹图谱，其特征在于，所述中华绒螯蟹dna指纹图谱优选包括长江水域中华绒螯蟹dna指纹图谱和辽河水域中华绒螯蟹dna指纹图谱，两种dna指纹图谱均包括78个snp位点，所述长江水域中华绒螯蟹dna指纹图谱的snp位点及特异性核苷酸如下：
3.一种权利要求1或者2所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述质控合格的dna片段上机重测序具体步骤为：将dna样品进行酶切片段化，用连接酶将测序接头与片段化dna链接在一起，对连接产物进行pcr扩增，用磁珠对pcr产物进行片段筛选，然后，将线性文库变性为单链后进行环化，形成单链环状文库，经过滚环复制形成dna纳米球(dnb)，最后，利用加载设备mgidl-t7将dnb加载到测序芯片中，通过联合探针锚定聚合技术上机进行重测序。
5.根据权利要求3所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(4)中得到的测序数据进行过滤、测序数据污染检测和测序数据质量评估包括测序数据和质量指标汇总、测序数据碱基含量、测序数据污染检测。
6.根据权利要求3所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(5)中参考基因组为ncbi上的txid95602中华绒螯蟹全基因组。
7.根据权利要求3所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(5)中经过变异检测，获得每个样本的gvcf，使用sentieon进行joint-calling，对所有样本的gvcf进行联合分析，得到每个个体的变异结果，联合分析后得到的snp位点进行初步过滤(snp硬过滤标准：qd＜2.0||fs＞60.0||mq＜40.0||sor＞3.0||mqranksum＜-12.5||readposranksum＜-8.0)，得到中华绒螯蟹的特异性snp位点数据库。
8.根据权利要求3所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱的构建方法，其特征在于，步骤(6)中筛选标准为缺失率为0；maf值≥0.1；提取位点上下游100bp的序列进行拷贝数分析，保留上下游序列在基因组上是唯一的位点；位点杂合率<0.15uolv和位点深度>10进一步过滤。
9.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹dna指纹图谱在鉴定中华绒螯蟹不同水域的种质资源中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用的过程为：
