本发明涉及类器官与再生医学领域，尤其涉及一种将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法。
背景技术：
1、垂体是人体最重要的核心内分泌器官之一，在机体的应激反应、内环境稳态维持、代谢调节、生长发育以及生殖调控等众多生理过程中发挥着关键作用[1,2]。肿瘤、外伤、缺血、感染、药物、基因缺陷等因素可引起垂体激素分泌不足或过多，从而严重影响机体的生长发育和内环境稳态。由于垂体解剖位置特殊、垂体体积非常小、伦理审查等客观因素，研究者很难拿到足够的人类垂体组织样本进行研究，相关研究采用的大都是垂体细胞系或动物模型，但是动物垂体和垂体细胞系体外2d培养与真实的人类垂体之间存在较大差异，因此迫切需要用于人类垂体疾病研究的理想实验室模型。
2、类器官是指干细胞在体外经过三维培养形成的微型细胞簇或者微组织[3,4]，近年来，由于类器官能够更真实地模拟人体器官的结构和功能，被广泛应用于发育生物学、疾病建模、药物筛选、再生医学等研究领域[5]。目前肝脏[6]、心脏[7]、肺[8]、肠道[9]、脑[10]、肾脏[11]、皮肤[12]等类器官已被成功构建。与动物模型相比，垂体类器官可以克服种属差异性，与垂体细胞系相比，三维垂体类器官可以模拟体内细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，是研究垂体疾病和开发治疗手段的理想实验室模型。
3、将多能干细胞诱导为垂体类器官相当于在体外模拟体内垂体发育过程。垂体基板是起源于非神经外胚层的胚胎结构，可进一步分化发育形成垂体前叶组织，是垂体形成过程中的关键结构[15-18]。垂体基板早期表达配对样同源域1(paired like homeodomain1,pitx1)，晚期表达lim同源框3(lim homeobox 3,lhx3)，随后分化成垂体前叶细胞[19]。垂体基板的形成常常表明垂体的分化进入实质性阶段，是垂体形成的关键环节。因此将多能干细胞诱导为垂体类器官的关键在于能否将多能干细胞诱导为垂体基板类器官。
4、既往文献仅仅添加了骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,bmp4,bmp信号通路关键配体)和smo激动剂(smoothened agonist,sag,sonic hedgehog信号通路激活剂)这两种重要的因子或激活剂[14]，虽然bmp信号通路[20]和sonic hedgehog信号通路[21]对垂体的发育过程至关重要，但是仅仅依靠这两个信号通路的激活并不足以实现从多能干细胞到垂体基板类器官的高效诱导分化[13]。dincer等人[22]研究表明早期使用noggin抑制bmp信号通路，全程使用sb431542抑制tgf-β信号通路可以促进多能干细胞向six1+前基板外胚层的分化，而垂体基板来源于前基板外胚层的一部分，因此尝试在培养方法的早期阶段引入bmp信号通路抑制剂和tgf-β信号通路抑制剂或许可以促进多能干细胞向前基板外胚层及后续垂体基板的分化。成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor,fgf)信号通路的激活可以促进垂体基板的发育[23]，因此尝试在培养方法中引入fgf信号通路的细胞因子或激活剂或许可以促进多能干细胞向垂体基板的分化。研究表明敲除血清替代品(knockout serum replacement,ksr)中含有胰岛素，胰岛素可以通过激活pi3k/akt信号通路抑制多能干细胞向下丘脑方向的分化[24]，而ksr又是维持类器官营养和生长的必要成分，因此尝试在培养方法中引入akt信号抑制剂拮抗胰岛素的抑分化作用或许可以促进多能干细胞向垂体基板及垂体类器官的分化。
5、由于存在技术壁垒和实验难度，zhou等人[13]模仿了kasai等人[14]的培养方法，却只检测到了极少数acth阳性细胞，zhou等人并未能成功构建真正的垂体类器官，这说明将多能干细胞诱导为三维垂体类器官这一技术仍然十分不成熟，急需一种成熟且稳定的培养方法来构建三维垂体类器官。
技术实现思路
1、本发明提供了一种将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，可以稳定且高效地在体外构建三维垂体类器官，为垂体类器官在垂体发病机制研究、再生医学治疗、毒药物筛选等领域中的应用提供坚实的模型基础。
2、为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
3、本发明的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，包括：在一系列信号通路激活剂和抑制剂的作用下将多能干细胞在体外诱导为三维垂体基板类器官，其中，一系列信号通路激活剂和抑制剂包括bmp信号通路抑制剂、tgf-β信号通路抑制剂、细胞凋亡抑制剂、sonic hedgehog信号通路激活剂、bmp信号通路激活剂、fgf信号通路激活剂和akt信号通路抑制剂；以及将三维垂体基板类器官在sonic hedgehog信号通路激活剂和akt信号通路抑制剂的作用下逐步发育成熟，形成三维垂体类器官。
4、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，bmp信号通路抑制剂包括ldn-193189，tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542，细胞凋亡抑制剂包括y27632，sonic hedgehog信号通路激活剂包括smo激动剂(sag)，bmp信号通路激活剂包括骨形态发生蛋白4(bmp4)重组蛋白，fgf信号通路激活剂包括成纤维细胞生长因子2(fgf2)重组蛋白，以及akt信号通路抑制剂包括akt抑制剂viii。
5、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，将多能干细胞在体外诱导为三维垂体基板类器官的过程中，在第6到18天选用7.5nm的骨形态发生蛋白4(bmp4)作为bmp信号通路激活剂、第6到40天选用2μm的smo激动剂(sag)作为sonichedgehog信号通路激活剂、在第18到30天选用50ng/ml的成纤维细胞生长因子2(fgf2)作为fgf信号通路激活剂、第0到18天选用0.1μm的sb431542作为tgf-β信号通路抑制剂、第3到40天选用0.5μm的akt抑制剂viii作为akt信号通路抑制剂；第40天后，将三维垂体基板类器官在体外诱导为三维垂体类器官的过程中，选用2μm的smo激动剂(sag)作为sonic hedgehog信号通路激活剂以及0.5μm的akt抑制剂viii作为akt信号通路抑制剂。
6、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，采用垂体类器官培养基，其中，垂体类器官培养基的成分为：
7、第0天到第3天：gfcdm，7.5％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，20μm细胞凋亡抑制剂y27632，100nm bmp信号通路抑制剂ldn-193189和100nm tgf-β信号通路抑制剂sb431542；
8、第3天到第6天：gfcdm，7.5％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，100nm tgf-β信号通路抑制剂sb431542和0.5μm akt信号通路抑制剂akt抑制剂viii；
9、第6天到第18天：gfcdm，7.5％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，7.5nm骨形态发生蛋白4(bmp4)，2μm smo激动剂(sag)，100nm tgf-β信号通路抑制剂sb431542和0.5μm akt信号通路抑制剂akt抑制剂viii；
10、第18天到第30天：gfcdm，10％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，2μm smo激动剂(sag)，50ng/ml fgf信号通路激活剂成纤维细胞生长因子2(fgf2)和0.5μm akt信号通路抑制剂akt抑制剂viii；
11、第30天到第60天：gfcdm，15％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，2μm smo激动剂(sag)和0.5μm akt信号通路抑制剂akt抑制剂viii；
12、第60天后：gfcdm，20％(vol/vol)敲除血清替代品(ksr)，2μm smo激动剂(sag)和0.5μm akt信号通路抑制剂akt抑制剂viii；
13、其中，gfcdm为不含生长因子的化学成分明确的培养基。
14、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，将多能干细胞在体外诱导为三维垂体基板类器官之前，还包括多能干细胞的复苏与培养。
15、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，多能干细胞的复苏与培养，包括使用mtesr1培养基将多能干细胞培养在matrigel包被的六孔板中，待细胞克隆汇合度达70％进行传代培养或后续类器官诱导。
16、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，将多能干细胞在体外诱导为三维垂体基板类器官，包括：将多能干细胞在体外经过悬浮培养形成三维类球体，以及将三维类球体在一系列信号通路激活剂和抑制剂的作用下逐步发育成三维垂体基板类器官。
17、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，悬浮培养使用低粘附力96孔板，接种密度为5000个细胞/孔。
18、可选地，在上述将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法中，多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
19、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
20、本发明方法可以将多能干细胞在体外被稳定地诱导为三维垂体类器官，可以大大提高多能干细胞向垂体基板类器官分化的效率以及垂体基板类器官向垂体类器官分化的效率，而且缩短了分化时间，为垂体类器官的应用研究提供了坚实的模型基础。
1.一种将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，所述bmp信号通路抑制剂包括ldn-193189，所述tgf-β信号通路抑制剂包括sb431542，所述细胞凋亡抑制剂包括y27632，所述sonic hedgehog信号通路激活剂包括smo激动剂(sag)，所述bmp信号通路激活剂包括骨形态发生蛋白4(bmp4)重组蛋白，所述fgf信号通路激活剂包括成纤维细胞生长因子2(fgf2)重组蛋白，以及所述akt信号通路抑制剂包括akt抑制剂viii。
3.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，将所述多能干细胞在体外诱导为所述三维垂体基板类器官的过程中，在第6到18天选用7.5nm的骨形态发生蛋白4(bmp4)作为所述bmp信号通路激活剂、第6到40天选用2μm的smo激动剂(sag)作为所述sonic hedgehog信号通路激活剂、在第18到30天选用50ng/ml的成纤维细胞生长因子2(fgf2)作为所述fgf信号通路激活剂、第0到18天选用0.1μm的sb431542作为所述tgf-β信号通路抑制剂、第3到40天选用0.5μm的akt抑制剂viii作为所述akt信号通路抑制剂；第40天后，将三维垂体基板类器官在体外诱导为三维垂体类器官的过程中，选用2μm的smo激动剂(sag)作为所述sonic hedgehog信号通路激活剂以及0.5μm的akt抑制剂viii作为所述akt信号通路抑制剂。
4.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，采用垂体类器官培养基，其中，所述垂体类器官培养基的成分为：
5.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，将所述多能干细胞在体外诱导为所述三维垂体基板类器官之前，还包括所述多能干细胞的复苏与培养。
6.根据权利要求5所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，所述多能干细胞的复苏与培养，包括使用mtesr1培养基将所述多能干细胞培养在matrigel包被的六孔板中，待细胞克隆汇合度达70％进行传代培养或后续类器官诱导。
7.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，将所述多能干细胞在体外诱导为所述三维垂体基板类器官，包括：将所述多能干细胞在体外经过悬浮培养形成所述三维类球体，以及将所述三维类球体在所述一系列信号通路激活剂和抑制剂的作用下逐步发育成所述三维垂体基板类器官。
8.根据权利要求7所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，所述悬浮培养使用低粘附力96孔板，接种密度为5000个细胞/孔。
9.根据权利要求1所述的将多能干细胞诱导为三维垂体类器官的培养方法，其特征在于，所述多能干细胞包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的至少一种。
