本发明涉及微生物检测，具体涉及一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、大丽轮枝菌（ verticillium dahliae）是一种土传真菌，属于真菌界、子囊菌门、粪壳菌纲，是引起多种植物病害的病原体。大丽轮枝菌的寄主范围广泛，可以感染超过200种植物。它通过侵入植物根部并随着水分和养分的运输而进一步感染植物的导管系统。一旦感染，它会引起植物的黄化、萎蔫、凋萎和死亡等症状。大丽轮枝菌会引起多种植物的黄萎病，特别是对许多经济作物如棉花、茄子、番茄、土豆、香蕉、草莓和橄榄等造成了严重的病害。
2、大丽轮枝菌可以产生微菌核，在土壤中长期存活，并且通过植物残体、种子和土壤传播。它可以在适宜的环境下快速繁殖和传播，因此，对大丽轮枝菌的控制和管理对确保作物健康和减少经济损失至关重要。对大丽轮枝菌进行有效的防治，需要首先了解其在土壤中存在的状况，根据其在土壤中的丰度采取针对性的防治措施，因此开发快速准确的检测方法是极为重要的。
3、伴随着现代分子检测技术的发展，实时定量pcr（qpcr）和环介导等温扩增（lamp）等分子检测技术已经被开发来检测和量化大丽轮枝菌，这些技术能够提供比传统的培养和分离方法更快和更敏感的结果。qpcr法可以在扩增过程中实时监测dna的量，这种方法不仅可以检测到病原体是否存在，并且能够提供关于其在样品中的数量的信息，对于监测病原体的载量和疫情的早期预警尤其有用，但此方法依赖于昂贵的设备支持，不能实现现场快速检测。lamp法可以在恒定温度下进行样品dna的扩增，同时具有高度的特异性和灵敏度，由于lamp不需要复杂的仪器，使它成为现场快速检测的一个很好的选择，但通常不能像qpcr一样进行定量的检测，而且采用浊度法得到的检测结果，可视化辨别效果不理想。
技术实现思路
1、针对传统检测大丽轮枝菌的方法不能同时满足快速、定性检测和精确、定量检测的需求，本发明提供一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒及其应用。该试剂盒在普通lamp基础上，优化了可视化缓冲体系，采用taqman探针引物，实现对发病植物组织、土壤等样品中的大丽轮枝菌的快速和定量检测，既可以在现场通过可视化终点检测实现实时定性测定，也可以采用基于荧光探针的lamp和qpcr法实现快速定量检测。同时，本发明采用试剂盒的形式，便于在植物病害诊断与防治领域进行大规模推广。
2、第一方面，本发明提供一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，包括lamp引物组合、qpcr正向引物、taqman探针、lamp反应缓冲液和ph指示剂，lamp引物组合包括序列为seq idno.2的正向外引物vdtubf3、序列为seq id no.3的反向外引物vdtubb3、序列为seq idno.4的正向内引物vdtubfip、序列为seq id no.5的反向内引物vdtubbip、序列为seq idno.6的正向环引物vdtublf、序列为seq id no.7的反向环引物vdtublb；qpcr正向引物序列vdtaqf为seq id no.8，taqman探针的序列为seq id no.9。
3、进一步的，lamp反应缓冲液包括2~10mm硫酸铵、50mm的氯化钾、2~10mm硫酸镁、0.1wt%吐温20，lamp反应缓冲液的ph为8.0~8.8。
4、进一步的，taqman探针的5’端标记有报告荧光基团，报告荧光基团为fam、hex、tet、tamra、rox、cy3、cy5中的一种，优选为fam；taqman探针的3’端标记有淬灭荧光基团，淬灭荧光基团为bhq1、bhq2、bhq3、tamra、eclipse中的一种，优选为bhq1。
5、进一步的，ph指示剂为中性红、甲酚红、酚红中的一种，优选甲酚红；ph指示剂的质量浓度为0.1%。
6、第二方面，本发明还提供一种上述通用性大丽轮枝菌检测试剂盒在检测大丽轮枝菌方面的应用，检测步骤包括基因组dna提取、dna扩增和扩增产物检测。
7、进一步的，dna扩增的方法为探针法qpcr、普通lamp法、可视化lamp法和基于taqman探针的荧光lamp法中的一种或几种。
8、进一步的，探针法qpcr的反应体系如下：2×qpcr反应缓冲液10μl，10μm vdtaqf/vdtubb3 0.4μl，10μm taqman探针0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl。
9、进一步的，探针法qpcr的反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性5s，60℃延伸30smin，共40个循环。
10、进一步的，普通lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，引物混合液2μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μm vdtubf3/vdtubb3，4μm vdtublf/vdtublb。
11、进一步的，可视化lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，引物混合液2μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，0.1wt%甲酚红1μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μm vdtubf3/vdtubb3，4μmvdtublf/vdtublb。
12、进一步的，基于taqman探针的荧光lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，5u/μl taq酶0.2μl，引物混合液2μl，10μm taqman探针0.3μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μm vdtubf3/vdtubb3，4μm vdtublf/vdtublb。
13、进一步的，普通lamp法、可视化lamp法和基于taqman探针的荧光lamp法的反应程序如下：65℃恒温保持60min，85℃灭活5min。
14、本发明的有益效果在于：
15、1、本发明提供的一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，通用性强，一个试剂盒提供了普通lamp、可视化lamp、基于taqman探针的荧光lamp和探针法qpcr四种方式检测，可以依据不同需求实现大丽轮枝菌的定性、定量鉴定。经试验结果验证，该试剂盒检测大丽轮枝菌的特异性强、灵敏度高，可实现对大丽轮枝菌的精准、快速鉴定。使用该试剂盒，采用基于taqman探针的荧光lamp和探针法qpcr检测方式，对大丽轮枝菌的检测灵敏度极高，检测限低至100fg/μl。
16、2、本发明提供的一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，配合可视化lamp技术的检测方法可在恒温（60~65℃）条件下进行短时间反应，不需要贵重仪器设备，含有lf/lb引物，反应速度快，结果可直接通过反应前后反应管中颜色的显著变化来判断，可在30min完成反应，高含量样本最快可在15min内完成检测，能快速准确地检测出病原菌，可用于大丽轮枝菌的田间鉴定，也可用于对种子及土壤的检验检疫，技术价值高，应用前景广阔。
1. 一种通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，其特征在于，包括lamp引物组合、qpcr正向引物、taqman探针、lamp反应缓冲液和ph指示剂；lamp引物组合包括序列为seq id no.2的正向外引物vdtubf3、序列为seq id no.3的反向外引物vdtubb3、序列为seq id no.4的正向内引物vdtubfip、序列为seq id no.5的反向内引物vdtubbip、序列为seq id no.6的正向环引物vdtublf、序列为seq id no.7的反向环引物vdtublb；qpcr正向引物序列vdtaqf为seq id no.8，taqman探针的序列为seq id no.9。
2.如权利要求1所述的通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，其特征在于，lamp反应缓冲液包括2~10mm硫酸铵、50mm的氯化钾、2~10mm硫酸镁、0.1wt%吐温20，lamp反应缓冲液的ph为8.0~8.8。
3.如权利要求1所述的通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，其特征在于，taqman探针的5’端标记有报告荧光基团fam；taqman探针的3’端标记有淬灭荧光基团bhq1。
4.如权利要求1所述的通用性大丽轮枝菌检测试剂盒，其特征在于，ph指示剂为甲酚红，ph指示剂的质量浓度为0.1%。
5.一种如权利要求1-4任一项所述通用性大丽轮枝菌检测试剂盒在检测大丽轮枝菌方面的应用，其特征在于，检测步骤包括基因组dna提取、dna扩增和扩增产物检测。
6.如权利要求5所述应用，其特征在于，dna扩增的方法为探针法qpcr、普通lamp法、可视化lamp法和基于taqman探针的荧光lamp法中的一种或几种。
7. 如权利要求6所述应用，其特征在于，探针法qpcr的反应体系如下：2×qpcr反应缓冲液10μl，10μm vdtaqf/vdtubb3 0.4μl，10μm taqman探针0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl。
8. 如权利要求6所述应用，其特征在于，普通lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，引物混合液2μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μm vdtubf3/vdtubb3，4μmvdtublf/vdtublb。
9. 如权利要求6所述应用，其特征在于，可视化lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，引物混合液2μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，0.1wt%甲酚红1μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μmvdtubf3/vdtubb3，4μm vdtublf/vdtublb。
10. 如权利要求6所述应用，其特征在于，基于taqman探针的荧光lamp法的反应体系如下：10×lamp反应缓冲液2μl，40u bst dna聚合酶0.4μl，5u/μl taq酶0.2μl，引物混合液2μl，10μm taqman探针0.3μl，14mm dntp 2μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足20μl；引物混合液包括16μm vdtubfip/vdtubbip，2μm vdtubf3/vdtubb3，4μm vdtublf/vdtublb。
