本发明涉及生物技术生产领域，尤其是一种生产l-色氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术：
1、色氨酸（l-tryptophan，l-trp），化学名称为α-氨基-β-吲哚丙酸，是一种用途广泛的芳香族氨基酸，不仅参与蛋白质合成，还在人体的免疫调节中起至关重要的作用，是血清素、褪黑素的合成前体。近年来，随着人们对l-色氨酸生物活性认识不断深入以及其在应用领域不断扩大，全球市场对l-色氨酸的需求急剧增加，l-色氨酸供不应求，因此，提高l-色氨酸工业化产能极具现实意义。
2、l-色氨酸的生产方式主要是微生物发酵法，微生物发酵法是以葡萄糖等廉价原料作为碳源，采用微生物发酵的方式来实现的。在早期研究过程中，研究者培育l-色氨酸生产菌株时仅仅依据传统化学或者物理的诱变方式，该方式获得的生产菌株稳定性较差，产酸性能不高。而通过基因工程手段进行定向改造，则有望弥补诱变育种方式的不足。
3、大肠杆菌具有遗传背景清晰，基因编辑技术成熟，生长迅速，营养需求低的优点，是微生物发酵行业优良的出发菌株。目前大肠杆菌工程菌生产l-色氨酸主要存在产量与糖酸转化率较低的问题，当前国内市场主流色氨酸生产菌株糖酸转化率仅为17%-18%，且原料成本较高，严重制约了产能，因此，提高l-色氨酸生产菌株的糖酸转化率与产量，是目前亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种生产l-色氨酸的基因工程菌。
2、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产l-色氨酸的基因工程菌的构建方法。
3、本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述生产l-色氨酸的基因工程菌的应用。
4、为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
5、一种生产l-色氨酸的基因工程菌，为菌株ytp17，缺失了tnaa、tyrr、trpr基因，上调了trpefbr、arogfbr、serafbr、talb、arob、arod、aroe、arok、aroa、aroc、yddg基因的转录水平，强化了色氨酸操纵子trpefbrdcba中各基因簇trpefbrd、trpdc、trpba的表达，异源引入了短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶基因bbxfpk、枯草芽孢杆菌来源的glnafbr基因。
6、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，以 e.coliw3110作为出发菌株（底盘菌株），利用代谢工程手段进行基因编辑：
7、（1）敲除了编码色氨酸酶的 tnaa基因；
8、（2）敲除了编码阻遏蛋白tyrr、trpr的 tyrr、 trpr基因；
9、（3）用解除反馈抑制的邻氨基苯甲酸合成酶突变体 trpe fbr基因替换了原有的 trple基因，并用trc启动子启动；
10、（4）在假基因位点 yjiv串联整合了酶解除反馈抑制的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合酶突变体基因 arog fbr，并用trc启动子启动；
11、（5）在假基因位点 ilvg以及yeel位点分别整合了 talb基因；并均用trc启动子启动；
12、（6）在假基因位点yghe整合了编码短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶基因bbxfpk，并用并用trc启动子启动；
13、（7）在基因组 yjgx位点串联整合了 arob，arod，aroe基因形成一个微型操纵子 arobde，并用trc启动子启动；
14、（8）在基因组 ylbe位点串联整合了 arok，aroa，aroc基因形成一个微型操纵子 arokac，并用trc启动子启动；
15、（9）将色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分成 trpe fbr d，trpdc，trpba三个微型操纵子，分别整合至yjiv，yjit，yjip假基因位点，并均用bba_j23101启动子启动；
16、（10）在假基因位点ycdn整合了磷酸甘油酸脱氢酶突变体基因 sera fbr，并用trc启动子启动；
17、（11）在基因组mbha位点整合了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺合成酶突变体 glna fbr基因，并用trc启动子启动；
18、（12）在基因组rph位点与yjik位点分别整合了 yddg基因；并均用trc启动子启动。
19、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，所述 trpe fbr基因进行了定点突变，即在第118，119位碱基均由c变为t，导致第40位氨基酸残基由丝氨酸（s）变为苯丙氨酸（f）；上述 arog fbr基因进行了定点突变，即在第436位碱基均由g变为a，导致第146位氨基酸残基由天冬氨酸（d）变为天冬酰胺（n）；上述 sera fbr基因进行了定点突变，即在第1030，1031，1032位碱基分别由cac突变为gcg，导致第344位氨基酸残基由组氨酸（h）变为丙氨酸（a）；在第1036，1037，1038位碱基分别由aac突变为gcg，导致第346位氨基酸残基由天冬酰胺（n）变为丙氨酸（a）；上述 glna fbr基因进行了定点突变，即在第475，477位碱基分别由ta突变为ac，导致第159位氨基酸残基由亮氨酸（l）变为异亮氨酸（i）；在第911，912位碱基分别由aa突变为cg，导致第304位氨基酸残基由谷氨酸（e）变为丙氨酸（a）。
20、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，所述微型操纵子arobde，包括arob、arod、aroe基因，由同一个trc启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，通过优化基因连接方式与基因在操纵子中的存在位置获得，具体为：
21、（1）操纵子基因顺序为trc启动子、rbs、arob、arod、aroe、rrnb t1终止子；
22、（2）trc启动子、rbs核糖结合位点与arob基因首尾直接相连；
23、（3）aroe、rrnb t1终止子首尾直接相连。
24、微型操纵子arobde在基因组层面利用trc启动子启动，串联整合了 arob、 arod、 aroe，在基因序列中间插入rbs序列，使其形成一个微型人工操纵子，能够串联表达 arob基因编码的3-脱氢喹啉酸合酶， arod编码的3-脱氢喹啉脱水酶 ，aroe编码的莽草酸脱氢酶。
25、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，所述微型操纵子 arokac，包括arok、aroa、aroc基因，由同一个trc启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，通过优化基因连接方式与基因在操纵子中的存在位置获得，具体为：
26、（1）操纵子基因顺序为trc启动子、rbs、arok、aroa、aroc、rrnb t1终止子；
27、（2）trc启动子、rbs核糖结合位点与 arok基因首尾直接相连；
28、（3）aroc、rrnb t1终止子首尾直接相连。
29、微型操纵子 arokac在基因组层面利用trc启动子启动，串联整合了 arok、 aroa、 aroc，在基因序列中间插入rbs序列，使其形成一个微型人工操纵子，能够串联表达arok基因编码的莽草酸激酶，aroa编码的3-磷酸莽草酸-1-羧基乙烯基转移酶，aroc编码的分支酸合酶。
30、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，将改造后的色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分成 trpe fbr d、 trpdc和 trpba三个微型人工操纵子，分别整合至yjiv、yjit、yjip假基因位点，并均用bba_j23101启动子启动转录。
31、上述人工微型操纵子 trpe fbr d通过将改造后的色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分获得，由bba_j23101启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，具体为：
32、（1）操纵子基因顺序分别为bba_j23101启动子、rbs、 trpe fbr d、rrnb t1终止子；
33、（2）bba_j23101启动子、rbs核糖结合位点分别与 trpe fbr基因首尾直接相连；
34、（3） trpe fbr d基因使用序列表seq id no.21所示的基因序列；
35、（4） trpd与rrnb t1终止子首尾直接相连。
36、上述操纵子 trpdc通过将改造后的色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分获得，由bba_j23101启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，具体为：
37、（1）操纵子基因顺序分别为bba_j23101启动子、rbs、 trpdc、rrnb t1终止子；
38、（2）bba_j23101启动子、rbs核糖结合位点分别与 trpd基因首尾直接相连；
39、（3） trpdc基因使用序列表seq id no.22所示的基因序列；
40、（4） trpc分别与rrnb t1终止子首尾直接相连。
41、上述操纵子 trpba通过将改造后的色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分获得，由bba_j23101启动子与rbs核糖体结合位点控制操纵子开始转录，由同一个rrnb t1终止子控制操纵子终止转录，具体为：
42、（1）操纵子基因顺序分别为bba_j23101启动子、rbs、 trpba、rrnb t1终止子；
43、（2）bba_j23101启动子、rbs核糖结合位点分别与 trpb基因首尾直接相连；
44、（3） trpba基因使用序列表seq id no.23所示的基因序列；
45、（4） trpa分别与rrnb t1终止子首尾直接相连。
46、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，所述出发菌株为 e.coliw3110 atcc27325。
47、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；bba_j23101启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.2所示；rbs的核苷酸序列如序列表seq id no.3所示；rrnb t1终止子的核苷酸序列如序列表seq id no.4所示； tnaa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示； tyrr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示； trpr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示；邻氨基苯甲酸合成酶突变体基因 trpe fbr是由 e.coliw3110来源的 trpe基因定点突变，其核苷酸序列如序列表seq id no.8所示；3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合酶突变体基因 arog fbr是由 e.coliw3110来源的 arog基因定点突变，其核苷酸序列如序列表seq id no.9所示； talb基因来源于 e.coliw3110，其核苷酸序列如序列表seq id no.10所示； bbxfpk基因来源于短双歧杆菌（ bifidobacterium brevis），其核苷酸序列如序列表seq id no.11所示； arob基因的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示； arod基因的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示； aroe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示；微型操纵子 arobde的核苷酸序列如序列表seq id no.15所示； arok基因的核苷酸序列如序列表seq id no.16所示； aroa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.17所示； aroc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.18所示；微型操纵子 arokac的核苷酸序列如序列表seq id no.19所示；改造后的色氨酸操纵子 trpe fbr dcba的核苷酸序列如序列表seq id no.20所示；微型操纵子 trpe fbr d的核苷酸序列如序列表seq id no.21所示；微型操纵子 trpdc的核苷酸序列如序列表seq id no.22所示；微型操纵子 trpba的核苷酸序列如序列表seq id no.23所示；磷酸甘油酸脱氢酶突变体基因 sera fbr是由 e.coliw3110来源的 sera基因定点突变，其核苷酸序列如序列表seq idno.24所示；谷氨酰胺合成酶突变体 glna fbr基因来源于枯草芽孢杆菌，其核苷酸序列如序列表seq id no.25所示； yddg基因来源于 e.coliw3110，其核苷酸序列如序列表seq id no.26所示。
48、上述生产l-色氨酸的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
49、（1）构建底盘菌株：以 e.coliw3110为出发菌株，敲除l-色氨酸分解途径基因 tnaa；敲除阻遏调控蛋白基因 tyrr、 trpr；引入解反馈后的3-脱氧-7-磷酸庚酮酸合酶基因 arog fbr，将色氨酸操纵子中的 trple基因作为假基因位点插入trpefbr基因；
50、（2）强化芳香族化合物前体4-磷酸赤藓糖供给：在基因组以双拷贝形式整合了转醛缩酶基因talb；异源引入了短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶基因bbxfk，基因均使用trc启动子强化转录；
51、（3）加强莽草酸、分支酸途径碳通量：将莽草酸，分支酸途径关键酶串联表达，构建人工操纵子 arobde和 arokac，通过trc启动子强化人工操纵子的转录；
52、（4）优化色氨酸操纵子表达：将色氨酸操纵子 trpe fbr dcba拆分成三个人工操纵子 trpe fbr d，trpdc，trpba，并整合至假基因位点 yjiv， yjit， yjip，且均使用trc启动子强化转录；
53、（5）提高色氨酸合成途径中丝氨酸、谷氨酰胺供应：丝氨酸是合成色氨酸直接前体之一，谷氨酰胺为色氨酸合成提供氨基，因此，在基因组过表达d-3-磷酸甘油酸脱氢酶解反馈基因 sera fbr异源引入枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺合成酶解反馈基因 glna fbr,基因均使用trc启动子强化转录；
54、（6）强化l-色氨酸输出能力：在基因组以双拷贝形式过表达芳香族输出蛋白基因yddg，基因均使用trc启动子强化转录。
55、上述生产l-色氨酸的基因工程菌在发酵生产l-色氨酸方面的应用。
56、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，使用机械搅拌式发酵罐进行发酵，具体步骤如下：
57、（1）斜面培养：取l-色氨酸生产菌株接种在斜面培养基上作为第一代斜面培养，36-37℃培养12-16h；斜面培养基选用通用lb固体培养基；取第一代斜面培养的菌落接种于新的斜面培养基作为第二代斜面培养，36-37℃培养10-12h；
58、（2）种子培养：将第二代斜面用无菌水洗至种子培养基中，培养温度为36℃，通过生物反应器控制自动流加25%氨水溶液维持种子液ph在7.0±0.2，溶氧值30-50%，种子液od600nm达到15即进行下一步发酵培养；
59、（3）发酵培养：接种量为20%，培养温度为37℃，通过生物反应器控制自动流加 25%氨水溶液维持种子液ph在7.0±0.2，溶氧值30%-50%。
60、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，所述步骤（2）中种子培养基为：葡萄糖20-40 g/l，酵母浸出粉2-5 g/l，硫酸铵1-5 g/l，磷酸二氢钾1-5 g/l，无水硫酸镁0.5-2 g/l，七水硫酸亚铁10-30 mg/l，一水硫酸锰10-30 mg/l，vh0.1-0.5 mg/l，vb1 0.5-1mg/l，其余为水。
61、优选的，上述生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，所述步骤（3）中发酵培养基为：葡萄糖20-40 g/l，酵母浸出粉2-5 g/l，硫酸铵1-5 g/l，磷酸二氢钾1-5 g/l，无水硫酸镁0.5-2 g/l，七水硫酸亚铁30-60 mg/l，一水硫酸锰20-40 mg/l，vh0.1-0.5 mg/l，vb1 0.5-1mg/l。
62、上述培养基均可采用标准方法制备获得。
63、有益效果：
64、上述生产l-色氨酸的基因工程菌，通过对大肠杆菌中色氨酸相关的代谢流进行分析重构，并通过异源引入了短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶，加强了芳香族氨基酸合成原料4-磷酸赤藓糖、磷酸烯醇式丙酮酸的供应；异源引入了枯草芽孢杆菌来源的谷氨酰胺合成酶，加强了色氨酸合成途径中氨基供体-谷氨酰胺的供应；另通过构建人工操纵子加强基因簇串联表达，实现了针对莽草酸途径以及分支酸途径的强化，并优化了色氨酸合成前体丝氨酸的合成途径与l-色氨酸输出系统，最终得到的l-色氨酸生产菌株遗传背景清晰，具有良好的生产l-色氨酸能力，性能稳定，糖酸转化率高，能通过微生物直接发酵法稳定高效地生产或积累l-色氨酸，通过5l发酵罐40h发酵，最终产量达到52.3g/l，转化率达到20%，具有良好的应用价值。
1.一种生产l-色氨酸的基因工程菌，其特征在于：缺失了tnaa、tyrr、trpr基因，上调了trpefbr、arogfbr、serafbr、talb、arob、arod、aroe、arok、aroa、aroc、yddg基因的转录水平，强化色氨酸操纵子trpefbrdcba中各基因簇trpefbrd、trpdc、trpba的表达，异源引入了短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶基因bbxfpk、枯草芽孢杆菌来源的glnafbr基因。
2.根据权利要求1所述的生产l-色氨酸的基因工程菌，其特征在于：以e.coli w3110作为出发菌株，敲除了 tnaa、tyrr、trpr基因；利用trc启动子强化了trpefbr基因转录，并整合到了trple基因位点；利用trc启动子强化了arogfbr基因转录，并整合到了yjiv假基因位点；利用trc启动子强化了talb基因转录，并在基因组以双拷贝形式分别整合到了ilvg和yeel假基因位点；利用trc启动子强化了短双歧杆菌来源的磷酸酮醇酶基因bbxfpk转录，并整合到了yghe假基因位点；利用trc启动子强化了arob，arod，aroe基因转录，并整合到了yjgx假基因位点，形成一个微型操纵子；利用trc启动子强化了arok，aroa，aroc基因转录，并整合到了ylbe假基因位点，形成一个微型操纵子；将改造后的色氨酸操纵子trpefbrdcba拆分成trpefbrd，trpdc，trpba三个微型操纵子，利用bba_j23101启动子分别整合至yjiv，yjit，yjip假基因位点；利用trc启动子强化了serafbr基因转录，并整合到了ycdn假基因位点；利用trc启动子强化了枯草芽孢杆菌来源的glnafbr基因转录，并整合到了mbha假基因位点；利用trc启动子强化了yddg基因转录，并在基因组以双拷贝形式分别整合到了rph和yjik假基因位点。
3.根据权利要求2所述的生产l-色氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述出发菌株为e.coli w3110 atcc 27325。
4.根据权利要求1或2所述的生产l-色氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表seq id no.1所示；bba_j23101启动子的核苷酸序列如序列表seqid no.2所示；tnaa基因的核苷酸序列如序列表seq id no.5所示； tyrr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.6所示；trpr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.7所示；trpefbr的核苷酸序列如序列表seq id no.8所示；arogfbr的核苷酸序列如序列表seq id no.9所示；talb基因的核苷酸序列如序列表seq id no.10所示；bbxfpk基因的核苷酸序列如序列表seq id no.11所示；arob基因的核苷酸序列如序列表seq id no.12所示；arod基因的核苷酸序列如序列表seq id no.13所示；aroe基因的核苷酸序列如序列表seq id no.14所示；arok基因的核苷酸序列如序列表seq id no.16所示； aroa基因的核苷酸序列如序列表seqid no.17所示；aroc基因的核苷酸序列如序列表seq id no.18所示；色氨酸操纵子trpefbrdcba的核苷酸序列如序列表seq id no.20所示；微型操纵子trpefbrd的核苷酸序列如序列表seq id no.21所示；微型操纵子trpdc的核苷酸序列如序列表seq id no.22所示；微型操纵子trpba的核苷酸序列如序列表seq id no.23所示； serafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.24所示；glnafbr基因的核苷酸序列如序列表seq id no.25所示；yddg基因的核苷酸序列如序列表seq id no.26所示。
5.权利要求1-4之一所述生产l-色氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
6.权利要求1-4之一所述生产l-色氨酸的基因工程菌在发酵生产l-色氨酸方面的应用。
7.根据权利要求6所述的生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：使用机械搅拌式发酵罐进行发酵，具体步骤如下：
8.根据权利要求7所述的生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：所述步骤（2）中种子培养基为：葡萄糖20-40 g/l，酵母浸出粉2-5 g/l，硫酸铵1-5 g/l，磷酸二氢钾1-5 g/l，无水硫酸镁0.5-2 g/l，七水硫酸亚铁10-30 mg/l，一水硫酸锰10-30 mg/l，vh0.1-0.5 mg/l，vb1 0.5-1 mg/l，其余为水。
9.根据权利要求7所述的生产l-色氨酸的基因工程菌的应用，其特征在于：所述步骤（3）中发酵培养基为：葡萄糖20-40 g/l，酵母浸出粉2-5 g/l，硫酸铵1-5 g/l，磷酸二氢钾1-5 g/l，无水硫酸镁0.5-2 g/l，七水硫酸亚铁30-60 mg/l，一水硫酸锰20-40 mg/l，vh0.1-0.5 mg/l，vb1 0.5-1 mg/l。
