本发明属于细胞生物学及再生医学，具体涉及龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇的用途。
背景技术：
1、人诱导多能干细胞多能干细胞具有多能性，可以分化成几乎任何组织类型，并且能够模拟胚胎发育进程。
2、类器官（organoids）是由干细胞或者从病人身上提取的原代细胞在特定的3d体外微环境下自组织发育而来的、高度模拟体内真实器官特征的三维细胞复合体。类器官可以在很大程度模拟目标组织或器官的遗传特征和表观特征，在器官发育、精准医疗、再生医学、药物筛选、基因编辑、疾病建模等领域都有广泛的应用前景。
3、目前，lee等人2020年在nature发表了题为“hair-bearing human skingenerated entirely from pluripotent stem cells, doi: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2352-3”的文章，其中报道了一种将人诱导多能干细胞诱导形成皮肤类器官的方法，但使用该方法所制备的皮肤类器官获得率为41%左右，效率较低，难以大规模应用。
技术实现思路
1、基于此，本发明的目的在于提供龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇的用途，龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇可高效诱导人诱导多能干细胞形成皮肤类器官，诱导率高达63.89%±6.365%。
2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
3、本发明的第一方面，提供了龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇在诱导人诱导多能干细胞向皮肤类器官分化中的应用，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
4、本发明的第二方面，提供了龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇在制备诱导人诱导多能干细胞向皮肤类器官分化的培养基中的应用，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
5、本发明的第三方面，提供了一种诱导多能干细胞向皮肤类器官分化的培养基，所述培养基包含第一培养基和第二培养基，所述第一培养基包含肉豆蔻酸胆固醇；所述第二培养基包含龟板提取物，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
6、在一些实施例中，所述肉豆蔻酸胆固醇在所述第一培养基中的终浓度为1μm~200μm，所述龟板提取物在所述第二培养基中的终浓度为0.1μg/ml~50μg/ml。
7、在一些优选的实施例中，所述肉豆蔻酸胆固醇在所述第一培养基中的终浓度为5μm~100μm，所述龟板提取物在所述第二培养基中的终浓度为0.1μg/ml~30μg/ml。
8、在一些实施例中，所述第一培养基为包含以下终浓度的组分的基础培养基：1μm~20μm sb431542、1μm~200μm肉豆蔻酸胆固醇、1v/v%~5v/v%matrix basement membrane。
9、在一些实施例中，所述第二培养基为包含以下终浓度的组分的基础培养基：100ng/ml~1000ng/ml ldn193189和0.1μg/ml~50μg/ml龟板提取物。
10、在一些实施例中，所述基础培养基为e6培养基。
11、本发明的第四方面，提供了一种皮肤类器官的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
12、（1）将人诱导多能干细胞的单细胞悬液接种于细胞培养板中进行培养；
13、（2）将所述人诱导多能干细胞培养至形成细胞聚集体，利用第一阶段诱导分化培养基重悬所述细胞聚集体，然后将所述细胞聚集体接种于细胞培养板中进行诱导分化培养；所述第一阶段诱导分化培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：1μm~20μmsb431542、1μm~200μm肉豆蔻酸胆固醇、1v/v%~5v/v%matrix basement membrane；
14、（3）当诱导分化培养形成外胚层及表皮外胚层细胞后，向所述细胞培养板中加入第二阶段诱导分化培养基继续诱导分化培养；所述第二阶段诱导分化培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：100ng/ml~1000ng/ml ldn193189和0.1μg/ml~50μg/ml龟板提取物；
15、（4）当诱导分化培养形成颅神经嵴细胞后，使用第三阶段诱导分化培养基将步骤（3）获得的细胞聚集体进行重悬，然后接种于细胞培养板中，将所述细胞培养板置于摇床上进行悬浮培养；所述第三阶段诱导分化培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：1v/v%b-27 supplement、0.5v/v% n-2 supplement、100μg/ml normocin、1v/v% glutamax-1、0.1mm 2-mercaptoethanol、1v/v%matrix basement membrane；
16、（5）使用第三阶段诱导分化培养基诱导培养5~7天后，使用第四阶段诱导分化培养基进行半量换液，此后使用第四阶段诱导分化培养基持续培养至形成皮肤类器官，期间定期更换培养基；所述第四阶段诱导分化培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：1v/v%b-27 supplement、0.5v/v% n-2 supplement、100μg/ml normocin、1v/v% glutamax-1、0.1mm 2-mercaptoethanol。
17、在一些实施例中，步骤（1）所述人诱导多能干细胞的单细胞悬液的浓度为0.001×105～1×105个/μl。
18、在一些实施例中，步骤（1）使用的培养基为mtesr1培养基；和/或，
19、所述第一阶段诱导分化培养基的基础培养基为e6培养基；和/或，
20、所述第二阶段诱导分化培养基的基础培养基为e6培养基；和/或，
21、所述第三阶段诱导分化培养基的基础培养基包括advanced dmem/f12培养基、neurobasal培养基和keratinocyte-sfm培养基，且所述advanced dmem/f12培养基、neurobasal培养基和keratinocyte-sfm培养基的体积百分比为分别占总体积的28%～40%。
22、所述第四阶段诱导分化培养基的基础培养基包括advanced dmem/f12培养基、neurobasal培养基和keratinocyte-sfm培养基，且所述advanced dmem/f12培养基、neurobasal培养基和keratinocyte-sfm培养基的体积百分比为分别占总体积的28%～40%。
23、在一些实施例中，步骤（2）和/或步骤（4）中所述细胞聚集体接种的浓度为1个/孔。
24、在一些实施例中，步骤（4）中所述摇床的转速为10rpm~100rpm。
25、本发明提供了龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇在诱导人诱导多能干细胞形成皮肤类器官中的应用。发明人经过研究发现人诱导多能干细胞先使用含肉豆蔻酸胆固醇的培养基培养，再使用含龟板提取物的培养基培养，可成功诱导获得皮肤类器官，并且诱导率高达63.89%±6.365%。所形成的皮肤类器官具有表皮、真皮、毛囊、黑素细胞、神经细胞和脂肪细胞等，异体移植后能够实现新生毛发，可作为毛发来源用于脱发患者的植发手术，也可作为体外模型用于皮肤相关疾病体外研究以及皮肤毛囊发育研究。本发明方法诱导效率高，大规模应用前景好。
1.龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇在诱导人诱导多能干细胞向皮肤类器官分化中的应用，其特征在于，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
2.龟板提取物联合肉豆蔻酸胆固醇在制备诱导人诱导多能干细胞向皮肤类器官分化的培养基中的应用，其特征在于，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
3.一种诱导多能干细胞向皮肤类器官分化的培养基，其特征在于，所述培养基包含第一培养基和第二培养基，所述第一培养基包含肉豆蔻酸胆固醇；所述第二培养基包含龟板提取物，所述龟板提取物的提取试剂为乙酸乙酯。
4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述肉豆蔻酸胆固醇在所述第一培养基中的终浓度为1μm~200μm，所述龟板提取物在所述第二培养基中的终浓度为0.1μg/ml~50μg/ml。
5.如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述第一培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：1μm~20μm sb431542、1μm~200μm肉豆蔻酸胆固醇、1v/v%~5v/v%matrix basementmembrane；所述第二培养基为包含以下浓度组分的基础培养基：100ng/ml~1000ng/mlldn193189和0.1μg/ml~50μg/ml龟板提取物。
6.一种皮肤类器官的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的皮肤类器官的培养方法，其特征在于，步骤（1）所述人诱导多能干细胞的单细胞悬液的浓度为0.001×105～1×105个/μl。
8.如权利要求6所述的皮肤类器官的培养方法，其特征在于，步骤（1）使用的培养基为mtesr1培养基；和/或，
9.如权利要求6所述的皮肤类器官的培养方法，其特征在于，步骤（2）和/或步骤（4）中所述细胞聚集体接种的浓度为1个/孔。
10.如权利要求6所述的皮肤类器官的培养方法，其特征在于，步骤（4）中所述摇床的转速为10rpm~100rpm。
