本发明的领域涉及反义寡核苷酸组合物以及用于制备和使用它们的方法。
背景技术：
1、反义寡核苷酸(aso)是特异性地结合靶rna并引发期望的生物学和治疗效果的单链合成寡核苷酸。该技术领域的技术人员已经设计了能够调节与病毒、真菌和代谢疾病相关的基因表达的反义、三链体和其他寡核苷酸组合物，并且许多反义寡核苷酸已经被批准用作治疗动物和人类中疾病状态的治疗剂。例如，1998年，硫代磷酸酯寡核苷酸药物vitravene(isis 2922)被fda批准用于治疗aids患者的巨细胞病毒性视网膜炎。虽然反义寡核苷酸已经安全地施用于人类多年，但寡核苷酸设计方法中的某些挑战限制了这些分子充分发挥其治疗潜力的能力。
2、非常期望被设计为与靶rna特异性地结合并引发期望的生物学和治疗效果的aso。遗憾的是，rna分子倾向于形成复杂的二级结构，其干扰aso以适当的亲和力和特异性与期望的靶标结合，从而在该技术领域产生问题。
3、需要改进的用于制备反义寡核苷酸的方法以及通过此类方法制备的改进的反义寡核苷酸。例如，用于制备能够结合与各种疾病状态相关的三维rna靶标的aso的新技术将为治疗性干预开辟新的机会，特别是对于产生先前被认为是无成药性的蛋白质的基因。
技术实现思路
1、如上文所指出，反义寡核苷酸是一类适合于对抗很多种疾病的新兴药物。本文公开的发明集中于用于制备此类反义寡核苷酸的新的基于结构的设计方法。本文公开的本发明的实施方案包括在aso设计策略中考虑靶rna结构的三维架构的方法。此类基于结构的方法可以用于制备靶向对多种疾病状态至关重要的rna的新aso。在该背景下，本公开包括已经被发现对设计此类非常规aso令人惊讶地有用的选择方法。例如，本文公开的方法可以用于设计aso，其包含与模板电子等排并且增强aso/靶标相互作用的核苷酸碱基三联体、hoogsteen配对等。本文通过本发明的说明性aso组合物的生化分析进一步证明了aso靶标结合中此类三级相互作用的效用和重要性。
2、用于制备本文公开的3d-aso的过程通常包括多个步骤，其包括首先鉴定要靶向的特定rna序列。这些靶序列包括但不限于外显子、mrna剪接位点、对剪接很重要的内含子区、程序性核糖体移码元件、微小rna结合位点、蛋白质结合位点、聚腺苷酸化信号、翻译起始位点和5’和3’utr中的其他功能上重要的位点。在该背景下，可以使用rna二级结构预测程序(如rnastructure16和mfold17)来鉴定靶序列的三维结构。rna二级结构预测程序最通常提供一系列具有低自由能水平的结构。通常，使用rna二级结构预测程序以高频率鉴定具有低自由能水平的期望靶标结构。例如，rna环结构被认为是本文公开的3d-aso设计的高度期望的靶标。相比之下，在本文公开的aso设计方法中，可以忽略由rna二级结构预测程序鉴定的置信度相对弱或低的自由能结构。此外，靶rna的结构在游离状态和aso结合状态下不必相同。有时目的是破坏天然靶rna结构。在此类情况下，本文公开的3d-aso可以充当天然存在的核糖核苷酸分子的三维结构的调节剂，例如通过扰动此类天然存在的核苷酸分子的结构的一部分和/或形成此类天然存在的核苷酸分子的替代结构。
3、本文提供的本公开描述了一种新型设计方法，并且进一步呈现了由此类方法制备的一系列说明性3d-aso产物。在某些说明性工作实施方案中，本公开提供了显示某些3d-aso设计通过靶向sars-cov-2rna针对人细胞中的sars-cov-2病毒复制的强烈抑制的数据。这些数据证明了本文公开的结构设计方法以及由这些方法制备的aso的力量和独特价值。
4、下文讨论了本文公开的方法的详细方面。通常，在本发明的方法中，一旦适当的发夹或双链体结构被鉴定为天然存在的rna分子中的rna靶序列，就采取特定的核苷酸选择步骤来设计结合该靶标的3d-aso序列。例如，如下文中所讨论的，可以使用设计模板来选择待安置在此类aso序列的5’和/或3’端上的核苷酸，其可以与天然存在的rna分子形成非规范碱基配对，而aso中的其他内部核苷酸是由于其与此类rna分子中的靶寡核苷酸序列的序列互补性而被选择的。当两个rna结构在靶天然存在的rna分子内适当地间隔开时，aso的两端可以被修饰为促进结合，例如使用本文公开的3d模板。例如，在显示在图13中的示例性模板a-d中，最强的约束来自桥接大沟和小沟区段的hoogsteen对。因此，基于这些模板设计3d-aso的第一步是确定与靶标形成hoogsteen对的核苷酸是否可以在被设计为靶向特定rna的aso中进行工程化改造。如果是，则设计可以集中在aso的一端或两端(例如，aso的5’端的前5个核苷酸和aso的3’端的最后5个核苷酸)，以便优化大沟和小沟相互作用。如果否，则可以替代地探索靶rna结构的动态变体，或应用一个或多个模板e-h，其不需要hoogsteen对来桥接大沟和小沟区段。在模板a、c、e和g中，5’端aso残基从其小沟识别靶标的螺旋结构，但提供对其序列的有限特异性。因此，通常可以将2-3个3d-aso残基专用于与大沟或小沟区段相互作用(即，形成结合相互作用)。此外，所选择的核苷酸(如图16所示的那些)的特性可以用于选择用于与靶标寡核苷酸序列的大沟和小沟区段相互作用的3d-aso核苷酸/序列。在模板b、d、f和h中，3’aso残基从其大沟识别靶标的螺旋结构，并且经由大沟碱基三联体识别序列。
5、如上文所指出，在本发明的典型实施方案中，核苷酸被选择并且安置在aso中，以便与靶序列形成非规范和规范碱基配对，例如，非规范碱基配对通常被设计为出现在存在于aso的3’和5’末端中的1-5个核苷酸中，并且规范碱基配对通常被设计为出现在这些aso的其他核苷酸中。此类非规范和规范碱基配对组合使得设计新的3d-aso成为可能，该新的3d-aso与天然存在的rna分子中的靶序列结合，并具有出乎意料的低自由能概况。下文中关于被设计为靶向sars-cov-2rna的aso的公开证明了本文公开的结构设计方法以及由这些方法制备的aso的力量和独特价值。
6、根据以下的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点对本领域技术人员而言将变得显而易见。然而，应当理解，在指示本发明的一些实施方案的同时，详细描述和具体实例是通过说明而非限制的方式给出的。在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行本发明的范围内的许多改变和修改，并且本发明包括所有此类修改。
1.一种用于制备反义寡核苷酸产物的方法，其包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
3.根据权利要求1所述的方法，其中：
4.根据权利要求1所述的方法，其中：
5.根据权利要求4所述的方法，其中
6.根据权利要求2所述的反义寡核苷酸产物，其中所述反义寡核苷酸产物包含以下中的至少一种：
7.根据权利要求1所述的方法，其中：
8.根据权利要求1所述的方法，其中：
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将所述反义寡核苷酸产物与药物、脂质体或纳米颗粒组合物组合。
10.一种由根据权利要求1所述的方法制备的反义寡核苷酸产物。
11.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸产物包含13至30个核苷酸。
12.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中：
13.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中：
14.根据权利要求13所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸包含以下中的至少一种：
15.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其进一步包含以下中的至少一种：药物赋形剂、脂质体或纳米颗粒。
16.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中所述靶序列存在于由病毒、细菌或真菌表达的核糖核苷酸中。
17.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中所述靶序列存在于由人细胞表达的核糖核苷酸中。
18.根据权利要求10所述的反义寡核苷酸，其中所述靶序列存在于由人体寄生物表达的核糖核苷酸中。
19.根据权利要求16所述的反义寡核苷酸产物，其中靶序列存在于由以下项表达的核糖核苷酸中：
20.根据权利要求19所述的反义寡核苷酸产物，其中所述寡核苷酸包含以下序列：
