发明领域本发明涉及用于合成双环肽毒素偶联物(bicycle toxin conjugate，btc)(例如，bt8009)的方法，该双环肽毒素偶联物包含共价连接至强效抗微管蛋白剂mmae的约束双环肽(constrained bicyclic peptide)及其中间体。
背景技术：
0、发明背景
1、环肽能够与蛋白质以靶标高亲和力和靶标特异性结合，并且因此是用于开发治疗剂的有吸引力的分子类别。事实上，几种环肽已经在临床上成功地使用，例如抗菌肽万古霉素、免疫抑制药物环孢素或抗癌药物奥曲肽(driggers等人(2008),nat rev drug discov7(7),608-24)。良好的结合特性源于肽与靶标之间所形成的相对大的相互作用表面以及环状结构的降低的构象柔性。典型地，大环与几百平方埃的表面结合，例如环肽cxcr4拮抗剂cvx15(2；wu等人(2007),science 330,1066-71)、具有arg-gly-asp基序的与整合素αvb3(2)结合的环肽(xiong等人(2002),science 296(5565),151-5)或与尿激酶型纤溶酶原活化剂结合的环肽抑制剂upain-1(2；zhao等人(2007),j struct biol160(1),1-10)。
2、由于其环状构型，肽大环比线性肽柔性差，导致在与靶标结合时更小的熵损失并且导致更高的潜在结合亲和力。降低的柔性也导致锁定靶标特异性构象，与线性肽相比，增加了结合特异性。该效应已经通过基质金属蛋白酶8(mmp-8)的强效和选择性抑制剂来例证，其在其环被打开时丧失其相对于其他mmp的选择性(cherney等人(1998),j med chem41(11),1749-51)。通过大环化获得的有利结合特性在具有多于一个肽环的多环肽中更加明显，例如在万古霉素、乳链菌肽和放线菌素中。
3、不同的研究团队先前已经将多肽与半胱氨酸残基拴系成合成的分子结构(kemp和mcnamara(1985),j.org.chem；timmerman等人(2005),chembiochem)。meloen及其同事使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化到合成支架上用于蛋白质表面的结构模拟(timmerman等人(2005),chembiochem)。wo 2004/077062和wo 2006/078161中公开了用于产生候选物药物化合物的方法，其中所述化合物通过将含有半胱氨酸的多肽连接至分子骨架例如三(溴甲基)苯来产生。
4、已经开发了基于噬菌体展示的组合方法来产生和筛选针对目的靶标的双环肽的大型库(heinis等人(2009),nat chem biol 5(7),502-7和wo2009/098450)。简言之，在噬菌体上展示含有三个半胱氨酸残基和六个随机氨基酸的两个区域(cys-(xaa)6-cys-(xaa)6-cys)的线性肽的组合库并且通过将半胱氨酸侧链共价连接至小分子(三(溴甲基)苯)来环化。
技术实现思路
0、发明概述
1、本发明提供了双环肽毒素偶联物和制备方法。在一些实施方案中，本发明的双环肽毒素偶联物包含共价连接至强效抗微管蛋白剂mmae的约束双环肽。在一些实施方案中，双环肽毒素偶联物包含与nectin-4高亲和力和特异性结合的约束双环肽。
2、在一些实施方案中，本发明提供了一种式i的双环肽毒素偶联物：
3、
4、或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、m和n中的每个如以下所定义并且在本文的实施方案中单独和组合地描述。
5、在一些实施方案中，本发明提供了一种用于根据如本文所描述的方案和步骤制备本发明的双环肽毒素偶联物或其合成中间体的方法。
6、在一些实施方案中，本发明提供了一种用于预防和/或治疗如本文所描述的癌症的方法，其包括向患者给予本发明的双环肽毒素偶联物。
7、在一些实施方案中，本发明提供了一种可用于制备本发明的双环肽毒素偶联物的合成中间体或其组合物。
1.一种制备式i的化合物或其盐的方法，其包括以下步骤：1)提供片段f-2
2.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)反应使用约1当量的片段f-2。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中步骤2)反应在偶极非质子溶剂中。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述偶极非质子溶剂是n,n-二甲基乙酰胺(dma)。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中步骤3)的所述非极性溶剂是醚。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述醚是甲基叔丁基醚(mtbe)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其进一步包括通过柱色谱纯化式i的化合物或其盐。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中rrt 0.93处的杂质以相对式i的化合物小于约5％的面积形成。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述杂质小于约2.5％。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述杂质小于约1％。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述杂质小于约0.5％。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述杂质小于约0.05％。
13.一种制备片段f-2或其盐的方法，其包括以下步骤
14.如权利要求13所述的方法，其中步骤2)反应在偶极非质子溶剂中。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述偶极非质子溶剂是n,n-二甲基乙酰胺(dma)。
16.如权利要求13-15中任一项所述的方法，其中步骤3)的所述非极性溶剂是醚。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述醚是甲基叔丁基醚(mtbe)。
18.如权利要求13-17中任一项所述的方法，其进一步包括通过将所述反应溶液加入酸性饱和盐水溶液中来纯化片段f-2或其盐。
19.如权利要求18中任一项所述的方法，其进一步包括通过柱色谱纯化片段f-2或其盐。
20.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10和r11中的每个独立地是任选地取代的基团，所述基团选自c1-6脂族基团，3-8元饱和或部分不饱和单环碳环，苯基，8-10元双环芳族碳环，具有1-2个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的4-8元饱和或部分不饱和单环杂环，具有1-4个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的5-6元单环杂芳环，或具有1-5个独立地选自氮、氧或硫的杂原子的8-10元双环杂芳环。
21.如权利要求20所述的方法，其中r1是
22.如权利要求20所述的方法，其中r2是
23.如权利要求20所述的方法，其中r3是
24.如权利要求20所述的方法，其中r4是
25.如权利要求20所述的方法，其中r5是
26.如权利要求20所述的方法，其中r6是
27.如权利要求20所述的方法，其中r7是
28.如权利要求20所述的方法，其中r8是
29.如权利要求20所述的方法，其中r9是
30.如权利要求20所述的方法，其中r10是
31.如权利要求20所述的方法，其中r11是
32.如权利要求20-31中任一项所述的方法，其中所述式i的化合物是
33.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中片段f-3是或其盐。
34.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中片段f-2是或其盐。
35.如权利要求33所述的方法，其中片段f-3是或其盐。
36.如权利要求34所述的方法，其中片段f-2是或其盐。
37.如权利要求1-12或20-36中任一项所述的方法，其中所述式i的化合物是bt8009或其盐。
