本发明涉及可复制rna构建体/分子，其通过包含至少一个修饰的核苷酸如n1-甲基-假尿苷(1mψ)进行修饰，并且与相应的未修饰的可复制rna构建体/分子相比能够以相同或相似的水平复制和/或翻译。本发明的可复制rna构建体是指至少一部分被适当的rna依赖性rna聚合酶(复制酶)识别用于复制的区域不含有修饰的核苷酸的可复制rna构建体。本发明还涉及这类可复制rna分子在治疗中的用途。
背景技术：
1、最近，基于mrna的疫苗在抗击covid-19流行病的临床研究中证明了其免疫原性。这些rna疫苗非常有效，诱导非常强的t细胞免疫应答和高水平的中和抗体(walsh et al.，2020，n engl j med 383：2439-2450；sahin et al.，2020，nature 586：594-599)。获得监管部门批准的前两种mrna疫苗含有化学修饰的核苷酸，n1-甲基-假尿苷(1mψ)，而不是尿苷。这种修饰通过在很大程度上避免刺激先天免疫途径导致干扰素反应，提高了免疫活性(immune competent)细胞中mrna的翻译(andries et al.，2015，j control release 217：337-344)。
2、这些已批准的rna疫苗每剂需要30-100μg rna，并且需要连续两个剂量，间隔数周(初免-加强(prime-boost)方案)。这最终导致需要60-200g rna来免疫100万人。因此将剂量减少到1μg以下会对为人群提供针对新型病原体的疫苗所需的生产时间产生重大影响。
3、正在研究的有望实现显著减少剂量的疫苗方法是使用自扩增rna(sarna)。通过用期望对其免疫应答的抗原替代甲病毒结构基因，可以从甲病毒基因组工程化sarna。sarna编码甲病毒复制酶，其具有复制sarna分子的所有酶促功能，从而导致输入疫苗量的扩增。不幸的是，由sarna引起的先天免疫应答强烈抑制sarna疫苗的有效性，这可能是在非人灵长类的sarnacovid-19疫苗的临床前研究中使用了大量sarna的原因(erasmus et al.，2020，sci transl med 12：eabc9396)。
4、甲病毒是正链rna病毒的典型代表。甲病毒的宿主包括广泛的生物，包括昆虫、鱼和哺乳动物，如驯化动物和人。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见josé et al.，2009，future microbiol.4：837-856)。许多甲病毒的总基因组长度通常范围在11,000和12,000个核苷酸之间，并且基因组rna通常具有5’-帽和3’poly(a)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒rna的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(orf)。4种非结构蛋白(nsp1-nsp4)通常由基因组5′末端附近开始的第一orf一起编码，而甲病毒结构蛋白由第二orf一起编码，所述第二orf位于第一orf下游并延伸至基因组的3’末端附近。通常，第一orf比第二orf大，比例大约为2∶1。
5、在被甲病毒感染的细胞中，只有非结构蛋白从基因组rna翻译，而结构蛋白可从亚基因组转录物翻译，这是一种类似于真核信使rna的rna分子(mrna；gould et al.,2010,antiviral res.87:111-124)。感染之后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组rna直接充当信使rna，用于翻译编码非结构多聚蛋白(nsp1234)的开放阅读框。在一些甲病毒中，在nsp3和nsp4的编码序列之间存在乳白型(opal)终止密码子：当翻译终止于opal终止密码子时，产生含有nsp1、nsp2和nsp3的多聚蛋白p123，而在通读这个opal密码子时，产生额外含有nsp4的多聚蛋白p1234(strauss&strauss,1994,microbiol.rev.58:491-562；rupp et al.,2015,j.gen.virology 96:2483-2500)。nsp1234自蛋白水解切割为片段nsp123和nsp4。多肽nsp123和nsp4结合形成(-)链复制酶复合物，使用(+)链基因组rna作为模板转录(-)链rna。通常，在后期，nsp123片段被完全切割为单独的蛋白nsp1、nsp2和nsp3(shirako&strauss,1994,j.virol.68:1874-1885)。所有四种蛋白组装形成(+)链复制酶复合物，使用基因组rna的(-)链互补物作为模板合成新的(+)链基因组(kim et al.,2004,virology 323:153-163,vasiljeva et al.,2003,j.biol.chem.278:41636-41645)。
6、在感染的细胞中，亚基因组rna以及新基因组rna由nsp1提供5’-帽(petterssonet al.,1980,eur.j.biochem.105:435-443；rozanov et al.,1992,j.gen.virology 73:2129-2134)，由nsp4提供多腺苷酸[poly(a)]尾(rubach et al.,2009,virology 384:201-208)。因此，亚基因组rna和基因组rna都类似于信使rna(mrna)。
7、甲病毒结构蛋白(核心核衣壳蛋白c、包膜蛋白e2和包膜蛋白e1，病毒颗粒的所有组成成分)通常由亚基因组启动子控制的单个开放阅读框编码(strauss&strauss,1994,microbiol.rev.58:491-562)。亚基因组启动子被顺式作用的甲病毒非结构蛋白识别。特别地，甲病毒复制酶使用基因组rna的(-)链互补物作为模板合成(+)链亚基因组转录物。(+)链亚基因组转录物编码甲病毒结构蛋白(kim et al.,2004,virology 323:153-163,vasiljeva et al.,2003,j.biol.chem.278:41636-41645)。亚基因组rna转录物作为模板，将编码结构蛋白的开放阅读框翻译为一个多聚蛋白，切割多聚蛋白以产生结构蛋白。在宿主细胞中甲病毒感染的后期，位于nsp2编码序列内的包装信号确保将基因组rna选择性地包装为出芽病毒粒子，由结构蛋白包装(white et al.,1998,j.virol.72:4320-4326)。
8、在感染的细胞中，通常仅在感染后的前3-4h观察到(-)链rna合成，而在后期检测不到，此时仅观察到(+)链rna(基因组和亚基因组)的合成。根据frolov et al.,2001,rna7:1638-1651，rna合成调控的主流模型表明对非结构多聚蛋白加工的依赖性：非结构多聚蛋白nsp1234的初始切割产生nsp123和nsp4；nsp4作为rna依赖性rna聚合酶(rdrp)，对(-)链合成有活性，但是对(+)链rna的产生效率低下。多聚蛋白nsp123的进一步加工，包括在nsp2/nsp3连接处的切割，改变复制酶的模板特异性，以增加(+)链rna的合成并减少或终止(-)链rna的合成。
9、甲病毒rna的合成还受到顺式作用rna元件的调控，包括四个保守序列元件(cse；strauss&strauss,1994,microbiol.rev.58:491-562；和frolov,2001,rna 7:1638-1651)。甲病毒基因组包含四个保守序列元件(cse)，这些元件被认为对于宿主细胞中的病毒rna复制很重要。在病毒基因组的5’末端或附近发现的cse 1，被认为是从(-)链模版合成(+)链的启动子。位于cse 1下游但仍靠近nsp1编码序列内基因组5’末端的cse 2被认为是启动从基因组rna模板合成(-)链的启动子(注意，不包含cse 2的亚基因组rna转录物并不作为(-)链合成的模板)。cse 3位于非结构蛋白和结构蛋白编码序列之间的连接区域，是亚基因组转录物有效转录的核心启动子。最后，正好位于甲病毒基因组3’非翻译区中poly(a)序列上游的cse 4被认为是启动(-)链合成的核心启动子(joséet al.,2009,future microbiol.4:837-856)。据了解，甲病毒的cse 4和poly(a)共同发挥作用，以实现有效的(-)链合成(hardy&rice,2005,j.virol.79:4630-4639)。除甲病毒蛋白外，宿主细胞因子(可能是蛋白)也可以与保守序列元件结合。甲病毒基因组的5’复制识别序列不仅参与翻译起始，还包含参与病毒rna合成的两个保守序列元件cse 1和cse 2。对于cse 1和2的功能，据信二级结构比线性序列更重要(strauss&strauss,1994,microbiol.rev.58:491-562)。
10、已建议将甲病毒衍生的载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码所关注的蛋白的开放阅读框替换。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个单独的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶(通常为多聚蛋白nsp1234)，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此命名为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中同时存在这些核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许甲病毒复制酶进行识别和rna合成。
11、鉴于修饰的mrna疫苗的成功，修饰sarna以减少先天免疫应答似乎很有吸引力。然而，已观察到修饰的核苷酸抑制sarna的复制和翻译(erasmus et al.,2020,mol.ther.methods clin.dev.18:402–414)。迄今为止，还没有发表过为什么rna修饰与sarna功能不相容的研究。因此，尽管含有修饰的核苷酸，但本领域仍然需要具有充分复制和/或翻译功能的sarna分子。本发明满足了这种需求。
技术实现思路
1、本发明一般涉及提高自复制rna分子的能力，所述自复制rna分子也称为复制子或可复制(rrna)，其含有尿嘧啶、腺苷、胞嘧啶和鸟嘌呤以外的核苷酸，以复制和/或翻译来表达编码的蛋白。因此，本发明涉及含有修饰的核苷酸的可复制rna分子，其中至少一部分被适当的rna依赖性rna聚合酶(复制酶)识别用于复制的区域不含有修饰的核苷酸，以及这类修饰的可复制rna分子在方法中的用途，所述方法用于在细胞中表达蛋白，或者用于提高针对可复制rna分子编码的蛋白的免疫应答，优选细胞毒性免疫应答，以及用于治疗或预防疾病或病症，其中这样的免疫应答产生/导致这种疾病或病症的治疗或预防。
2、本发明部分基于以下假设：5’-或3’-保守序列元件(cse)内的rna二级结构在修饰其中所含核苷酸时改变它们的形状或稳定性。由于rna复制取决于rna模板与复制酶的相互作用，因此rna与复制酶的不正确相互作用会严重影响rna依赖性rna转录(和/或翻译)。由于rna结构取决于核苷酸序列，因此发明人提出，与含有例如1mψ代替cse 1中所有尿苷的cse 1相比，从修饰的rna的至少一部分中排除修饰的核苷酸可以使与复制酶正确相互作用的结构适应更有效的复制和/或翻译。如本文公开的实验结果所证明的，本发明人表明，除至少一部分cse 1外含有修饰的核苷酸的可复制rna导致修饰的可复制rna的功能改善。
3、在一方面，本发明涉及一种修饰的可复制rna分子(rrna)，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子包含序列auggcgga或augggcgg，其中这两个序列auggcgga或augggcgg中的u是尿苷；并且其中所述分子中剩余尿苷中的至少一个是修饰的尿苷，优选n1-甲基-假尿苷(1mψ)。
4、rrna可以是单链rna分子，可以被翻译(+-链)，并且可以或不可以编码rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，但是包含核苷酸序列，其使得该分子能够由单独提供的复制酶反式复制或由同一rrna编码的复制酶顺式复制。rrna分子也可以称为反式复制子或复制子。此外，rrna可以包含编码基因序列的野生型或密码子优化的序列，例如，抗原或报告基因，并且rrna可以包含一个或多个结构元件，所述结构元件针对rrna在稳定性和翻译效率方面的最大效力进行了优化(5'帽、5'utr、3'utr、poly(a)-尾、茎环结构等)。
5、在一实施方案中，rrna可以包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，优选为多聚蛋白(nsp1234)，其在表达和加工时形成rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，所述复制酶优选为甲病毒复制酶。
6、rrna基本上可以是单链、正链rna病毒的基因组，例如，甲病毒(alphavirus)、小rna病毒(picornavirus)、黄病毒(flavivirus)，其任选不编码病毒的功能性结构蛋白。复制酶可以源自自复制的rna病毒，如甲病毒，例如，塞姆利基森林病毒(semliki forestvirus)(sfv)、委内瑞拉马脑炎病毒(venezuelan equine encephalitis virus)(veev)、辛德毕斯病毒(sindbis virus)、东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis virus)、西方马脑炎病毒(western equine encephalitis virus)或基孔肯雅病毒(chikungunyavirus)。在一实施方案中，甲病毒可以是sfv、veev或辛德毕斯病毒。
7、在一实施方案中，5’调节区可以是没有起始密码子的调节区。在一实施方案中，复制酶和复制酶复制所需的rrna中的调节序列源自相同的甲病毒或不同的甲病毒。在rrna还包含编码复制酶的开放阅读框的情况下，通过将复制酶开放阅读框的翻译置于内部核糖体进入位点(ires)的翻译控制下，可以将复制酶开放阅读框的翻译与5’-末端帽解偶联(uncouple)。在一实施方案中，rrna可以未加帽。在一实施方案中，rrna可以具有开放阅读框，用于表达ires上游的其他基因。
8、在一实施方案中，所述分子中所有剩余尿苷都可以是1mψ。在一实施方案中，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的剩余尿苷可以是1mψ。
9、在一实施方案中，上述序列auggcgga或augggcgg可以位于分子的非编码区中，或者这些序列可以位于5’调节区中。在一实施方案中，序列auggcgga或augggcgg可以位于5’调节区中的保守序列元件1(cse 1)中。在一实施方案中，序列auggcgga或augggcgg可以位于分子的5’末端。在一实施方案中，这些序列可以进一步包含auggcgga或augggcgg所描述序列5’的额外核苷酸，任选地，其中所述额外核苷酸包含额外的orf和/或控制序列或者形成5’帽结构的一个或多个核苷酸。
10、在一方面，本发明涉及一种修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse 1)的10个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的尿苷中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，优选n1-甲基-假尿苷(1mψ)。在一实施方案中，除了cse 1的10个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，除了cse 1的5个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，除了cse 1的4个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，除了cse 1的3个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，除了cse 1的2个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，除了cse1中最5’的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
11、在一实施方案中，除了cse 1中第2位的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
12、在一实施方案中，其中rrna包含5’帽，cse 1的10个5’核苷酸包括5’帽的任何核苷酸。在一实施方案中，5’帽可以是g(5’)ppp(5’)au。在一实施方案中，5’帽可以是m7g(5’)ppp(5’)au。
13、在一实施方案中，rrna可以包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，优选为多聚蛋白(nsp1234)，其在表达和加工时形成rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，所述复制酶优选为甲病毒复制酶。
14、在一方面，本发明涉及一种修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse 1)内包含的最5’的u外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，优选n1-甲基-假尿苷(1mψ)。在一实施方案中，除了cse 1内包含的最5’的u外，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。在一实施方案中，除了cse 1内包含的最5’的u外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，rrna可以包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，优选为多聚蛋白(nsp1234)，其在表达和加工时形成rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，所述复制酶优选为甲病毒复制酶。
15、在一方面，本发明涉及一种5’加帽修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，优选n1-甲基-假尿苷(1mψ)。在一实施方案中，除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。在一实施方案中，除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。在一实施方案中，rrna可以包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，优选为多聚蛋白(nsp1234)，其在表达和加工时形成rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，所述复制酶优选为甲病毒复制酶。
16、在一方面，本发明涉及一种修饰的可复制rna分子，其包含至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，优选n1-甲基-假尿苷(1mψ)，并且其中所述分子包含具有序列npppnu的5’帽，其中所述5’帽中的u是未修饰的尿苷。此外，5’帽中的每个n可以是任何核苷酸，无论是修饰的或未修饰的，只要它不是修饰的尿苷，特别不是n1-甲基-假尿苷。在一实施方案中，5’帽具有序列npppau，其中a代表修饰或未修饰的腺苷核苷酸。例如，三磷酸键3’的修饰的核苷酸n或a可以具有修饰的核糖结构如2’-o-甲基化核糖(nm或am)，产生所谓的“cap 1”。相反，包含具有未甲基化核糖的三磷酸键3’的核苷酸n或a的帽通常被称作“cap 0”。nppp优选为鸟苷型核苷酸(gppp)，更优选为修饰的鸟苷核苷酸，如7-甲基-鸟核苷酸(m7gppp)。在一实施方案中，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。
17、在一实施方案中，所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其在表达和加工时形成rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，例如甲病毒复制酶。除了rrna可以包含编码复制酶的第二orf的实施方案之外，还有许多其他实施方案适用于本发明的任何方面。例如，这样的实施方案是所述分子进一步包含至少一个修饰的g、c或a。其他示例性实施方案包括所述分子具有修饰的骨架，例如，其中所述修饰的骨架包含至少一个硫代磷酸酯键，或者其中所述骨架中的所有键是硫代磷酸酯键。
18、其他实施方案包括rrna中唯一的核苷酸或核苷修饰是1mψ，或者甲病毒可以是sfv或veev。
19、在一实施方案中，rrna分子可以进一步包含一个或多个编码区，例如包含编码所关注基因的序列的一个或多个编码区。例如，编码的所关注基因可以是抗原或治疗性蛋白或核酸或报告基因。在一实施方案中，所述抗原是肿瘤、病毒、细菌或真菌抗原，或者过敏原。
20、在一实施方案中，rrna可以是稳定的rrna。
21、在一方面，本发明涉及一种编码本发明的rrna分子的dna分子。在一实施方案中，所述rrna分子或dna分子可以是线性或环状的。
22、在一实施方案中，rrna或dna分子可以用能够与rrna或dna分子形成颗粒的试剂配制，例如，所述试剂可以是脂质或聚亚烷基亚胺(polyalkyleneimine)。在各种实施方案中，脂质可以包含阳离子头基，和/或脂质可以是ph响应性脂质，和/或脂质可以是聚乙二醇化脂质。在一实施方案中，所述试剂可以与聚肌氨酸缀合。在一实施方案中，由rrna或dna分子以及试剂形成的颗粒可以是基于聚合物的聚合复合物(plx)或脂质纳米颗粒(lnp)，其中所述lnp优选是脂质复合物(lpx)或脂质体。在一实施方案中，所述颗粒可以进一步包含至少一个磷脂酰丝氨酸。在一实施方案中，所述颗粒可以是纳米颗粒，其中(i)纳米颗粒中正电荷的数量不超过纳米颗粒中负电荷的数量，和/或(ii)纳米颗粒具有中性或净负电荷，和/或(iii)纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为1.4:1或更少，和/或(iv)纳米颗粒的zeta电位为0或更少。在一实施方案中，纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比可以在1.4:1和1:8之间，优选在1.2:1和1:4之间。
23、在一实施方案中，rrna或dna可以配制或待配制为液体、固体或其组合。在一实施方案中，rrna或dna可以配制或待配制用于注射。在一实施方案中，rrna或dna可以配制或待配制用于肌肉内给药。在一实施方案中，rrna或dna可以配制或待配制为颗粒。在一实施方案中，所述颗粒是脂质纳米颗粒(lnp)或脂质复合物(lpx)颗粒。在一实施方案中，lnp颗粒包含((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)(((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate))、2-[(聚乙二醇)-2000]-n,n-双十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇。
24、在一实施方案中，rrna脂质复合物颗粒可以通过混合rrna与脂质体来获得。在一实施方案中，rrna脂质复合物颗粒可以通过混合rrna与脂质来获得。
25、在一实施方案中，rrna可以配制或待配制为胶体。在一实施方案中，rrna可以配制或待配制为颗粒，形成胶体的分散相。在一实施方案中，分散相中存在50％或更多、75％或更多或者85％或更多的rrna。在一实施方案中，rrna可以配制或待配制为包含rrna和脂质的颗粒。在一实施方案中，可以通过使溶于水相中的rrna与溶于有机相中的脂质接触形成颗粒。在一实施方案中，所述有机相可以包含乙醇。在一实施方案中，可以通过使溶于水相中的rrna与分散于水相中的脂质接触形成颗粒。在一实施方案中，分散于水相中的脂质形成脂质体。
26、在一方面，本发明涉及通过组合本发明的dna分子以及包含dna依赖性rna聚合酶和修饰核苷酸的体外转录混合物，任选在帽的存在下，体外转录本发明的dna分子。体外转录混合物还包含转录dna以产生本发明的rrna分子所必需的所有试剂。
27、适用于任何方面的另一实施方案是所关注的基因编码抗原(肿瘤、病毒、细菌、真菌、过敏原)或治疗性蛋白或核酸，或者5’调节区和编码的rna依赖性rna聚合物可以源自相同的甲病毒或可以源自不同的甲病毒。另一个是5’调节区没有起始密码子，或者rrna可以是体外转录的rna分子。
28、在一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本文所述的本发明的rrna以及药学可接受的载剂或赋形剂。
29、在一方面，本发明涉及本发明的修饰的可复制rna分子或包含这种rrna的药物组合物，其用于治疗。
30、在一方面，本发明涉及一种在受试者中提高免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药本发明的修饰的可复制rna分子或包含这种rrna的药物组合物。
31、在一方面，本发明涉及一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者给药本发明的修饰的可复制rna分子或包含这种rrna的药物组合物。
32、在一方面，本发明涉及一种向缺乏基因功能的受试者提供这种基因功能的方法，所述方法包括向受试者给药本发明的修饰的可复制rna分子或包含这种rrna的药物组合物。
33、本发明的方面内包括针对rna分子群体的实施方案，优选可复制rna分子群体，其中特定修饰的rrna以群体中存在的所有rna分子的百分比量存在于群体中。这些群体也可以用于本发明的方法，例如，用于提高免疫应答或治疗癌症的方法。
34、在一实施方案中，rrna分子群体包含修饰的可复制rna分子，量为群体中存在的所有rrna分子的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述修饰的可复制rna分子是5’加帽修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
35、在一实施方案中，rrna分子群体包含修饰的可复制rna分子，量为群体中存在的所有rrna分子的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述修饰的可复制rna分子包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子包含序列auggcgga或augggcgg，其中这些序列中的任一序列auggcgga或augggcgg中的u是尿苷；并且其中所述分子中剩余尿苷中的至少一个是修饰的尿苷。
36、在一实施方案中，rrna分子群体包含修饰的可复制rna分子，量为群体中存在的所有rrna分子的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述修饰的可复制rna分子包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse 1)的10个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的尿苷中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
37、在一实施方案中，rrna分子群体包含修饰的可复制rna分子，量为群体中存在的所有rrna分子的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述修饰的可复制rna分子包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse1)内包含的最5’的尿苷外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
38、在一实施方案中，rrna分子群体包含修饰的可复制rna分子，量为群体中存在的所有rrna分子的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述修饰的可复制rna分子包含至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，并且其中所述分子包含具有序列npppnu的5’帽，其中所述5’帽中的u是未修饰的尿苷，优选其中所述序列是npppau。
1.一种5’加帽修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
2.权利要求1的分子，其中除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。
3.权利要求1或2的分子，其中除了所述分子中的第一个5’尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
4.权利要求1-3中任一项的分子，其中所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其包含rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，优选甲病毒复制酶。
5.一种修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子包含序列auggcgga或augggcgg，其中任一序列中的u是尿苷；并且其中所述分子中剩余尿苷中的至少一个是修饰的尿苷。
6.权利要求5的分子，其中所述分子中所有剩余尿苷为1mψ。
7.权利要求5或6的分子，其中所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的剩余尿苷是1mψ。
8.权利要求5-7中任一项的分子，其中所述序列auggcgga或augggcgg位于所述分子的非编码区中。
9.权利要求5-8中任一项的分子，其中所述序列auggcgga或augggcgg位于5’调节区中。
10.权利要求5-9中任一项的分子，其中所述序列auggcgga或augggcgg位于5’调节区中的保守序列元件1(cse1)中。
11.权利要求5-10中任一项的分子，其中所述序列auggcgga或augggcgg位于所述分子的5’末端。
12.权利要求5-11中任一项的分子，其中所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其包含rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，优选甲病毒复制酶。
13.权利要求5-12中任一项的分子，其中所述序列auggcgga或augggcgg进一步包含分别在序列auggcgga或augggcgg的5’的额外核苷酸。
14.权利要求13的分子，其中所述额外核苷酸包含额外的orf和/或控制序列或者形成5’帽结构的一个或多个核苷酸。
15.一种修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse 1)的10个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的尿苷中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
16.权利要求15的分子，其中除了cse 1的10个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
17.权利要求15或16的分子，其中除了cse 1的5个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
18.权利要求15-17中任一项的分子，其中除了cse 1的4个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
19.权利要求15-18中任一项的分子，其中除了cse 1的3个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
20.权利要求15-19中任一项的分子，其中除了cse 1的2个5’核苷酸内包含的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
21.权利要求15-20中任一项的分子，其中除了cse 1中最5’的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
22.权利要求15-21中任一项的分子，其中除了cse 1中第2位的尿苷外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
23.权利要求15-22中任一项的分子，其中所述分子包含5’帽，并且cse1的10个5’核苷酸包括5’帽的任何核苷酸。
24.权利要求15-23中任一项的分子，其中所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其包含rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，优选甲病毒复制酶。
25.一种修饰的可复制rna分子，其包含甲病毒的5’调节区和至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中除了5’调节区中包含的保守序列元件1(cse1)内包含的最5’的尿苷外，所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷。
26.权利要求25的分子，其中除了cse1内包含的最5’的u外，所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。
27.权利要求25或26的分子，其中除了cse1内包含的最5’的u外，所述分子中的所有尿苷为1mψ。
28.权利要求25-27中任一项的分子，其中所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其包含rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，优选甲病毒复制酶。
29.一种修饰的可复制rna分子，其包含至少一个编码至少一种所关注的基因产物的开放阅读框(orf)，其中所述分子中的至少一个尿苷是修饰的尿苷，并且其中所述分子包含具有序列npppnu的5’帽，其中所述5’帽中的u是未修饰的尿苷，优选其中所述序列是npppau。
30.权利要求29的分子，其中所述分子中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的尿苷是1mψ。
31.权利要求29或30的分子，其中所述分子包含第二orf，所述第二orf编码非结构蛋白1、2、3和4，其包含rna依赖性rna聚合酶(复制酶)，优选甲病毒复制酶。
32.权利要求1-31中任一项的分子，其中所述修饰的尿苷是n1-甲基-假尿苷。
33.权利要求1-32中任一项的分子，其中所述分子进一步包含至少一个修饰的g、c或a。
34.权利要求1-33中任一项的分子，其中所述分子具有修饰的骨架。
35.权利要求34的分子，其中所述骨架包含至少一个硫代磷酸酯键，优选其中所有键是硫代磷酸酯键。
36.权利要求1-35中任一项的分子，其中唯一的核苷酸或核苷修饰是1mψ。
37.权利要求1-36中任一项的分子，其中所述甲病毒是sfv或veev。
38.权利要求1-37中任一项的分子，其中所关注的基因编码抗原(肿瘤、病毒、细菌、真菌、过敏原)或治疗性蛋白或核酸。
39.权利要求1-38中任一项的分子，其中所述5’调节区和编码的rna依赖性rna聚合酶源自相同的甲病毒或源自不同的甲病毒。
40.权利要求1-39中任一项的分子，其中所述5’调节区没有起始密码子。
41.权利要求1-40中任一项的分子，其是体外转录的rna分子。
42.权利要求1-41中任一项的分子，其用脂质配制。
43.一种药物组合物，其包含权利要求1-42中任一项的分子以及药学可接受的载剂或赋形剂。
44.权利要求1-42中任一项的修饰的可复制rna分子或权利要求43的药物组合物，其用于治疗。
45.一种提高受试者的免疫应答的方法，所述方法包括给药权利要求1-42中任一项的修饰的可复制rna分子或权利要求43的药物组合物。
46.一种修饰的可复制rna分子，其用于提高受试者的免疫应答，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-42中任一项的分子或权利要求43的药物组合物。
47.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-42中任一项的修饰的可复制rna分子或权利要求43的药物组合物。
48.一种修饰的可复制rna分子，其用于治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-42中任一项的分子或权利要求43的药物组合物。
49.一种向缺乏基因功能的受试者提供这种基因功能的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-42中任一项的修饰的可复制rna分子或权利要求43的药物组合物。
50.一种修饰的可复制rna分子，其用于向缺乏基因功能的受试者提供这种基因功能的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求1-42中任一项的分子或权利要求43的药物组合物。
