本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种具有特异性肿瘤杀伤作用的细胞外囊泡，尤其是靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡的制备方法。
背景技术：
1、肿瘤免疫治疗领域中，car-nk细胞疗法采用基因工程修饰，在自然杀伤细胞(natural killer cell，nk)上添加特异性的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)结构，降低了nk细胞在靶向和杀死癌细胞时对正常细胞的伤害。此外，为进一步提高car-nk细胞疗法的有效性，有研究者以肿瘤坏死因子受体超家族成员死亡受体5(deathreceptor，dr5)作为抗肿瘤药物靶点。该受体在正常细胞中表达量相对较低，在多种肿瘤细胞中则高表达，其与配体结合后可诱导表达dr5的细胞在激活后凋亡。然而，目前进入临床试验的car-nk细胞疗法在治疗实体瘤上仍有很大的局限，除细胞尺寸过大，限制了免疫细胞进入实体瘤外，高度免疫抑制性的肿瘤微环境也抑制了免疫细胞在肿瘤内部的活化，还可能诱导活化的免疫细胞失活。
2、现有体外研究证明，car-nk细胞分泌的细胞外囊泡car-nk-ev能够包裹颗粒酶、穿孔素以及促炎细胞因子等物质，介导与nk细胞相似的细胞杀伤过程。作为一种细胞主动释放的纳米级膜囊泡，car-nk-ev具备特异性肿瘤细胞杀伤作用，直径小，肿瘤渗透率高，药物递送量高，现已成为解决car-nk细胞治疗疗效受限问题的重要研究方向。
3、根据细胞外囊泡的生物合成或释放途径，可将其主要分为外泌体、微囊泡和凋亡小体三类。目前，有研究人员制备了靶向her2高表达的乳腺癌细胞的car-nk细胞源外泌体和靶向cd20高表达的淋巴瘤细胞的car-nk细胞源外泌体。然而，现有技术中仍缺乏以肿瘤细胞dr5作为靶点的细胞外囊泡。
4、与此同时，为提高肿瘤治疗效果，进入临床试验的现有外囊泡药物注射量相对较高，极有可能激发固有免疫。在每周给药1.3×1013树突细胞外泌体治疗非小细胞肺癌的临床试验中，三分之一的患者出现了nk细胞裂解和特异性t细胞显著升高的现象，预示了细胞因子风暴的风险。此外，肿瘤摄取率低，杀伤效果差以及细胞外囊泡产量低也是亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服现有技术不足，解决上述背景技术中提到的缺乏以肿瘤细胞dr5作为靶点的细胞外囊泡的问题。
2、为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明的第一方面，提供一种制备靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡的方法，所述方法包括：在car-nk细胞上装载anti-dr5scfv模块、ccr2-irgd模块、rab27模块；对所述car-nk细胞进行传代增殖和纯化；提取所述靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡；利用所述靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡装载内容物。
4、在一些实施例中，所述在car-nk细胞上装载特定模块包括：构建含该模块基因的病毒载体；利用所述含该模块基因的病毒载体转染所述car-nk细胞；筛选所述car-nk细胞，其中所述特定模块包括anti-dr5 scfv模块、ccr2-irgd模块和/或rab27模块。
5、优选地，所述利用含anti-dr5 scfv基因的病毒载体转染car-nk细胞中，感染复数为5。
6、在一些实施例中，所述对car-nk细胞进行传代增殖和纯化包括利用α-mem培养基培养所述car-nk细胞；所述α-mem培养基添加浓度为20ng/ml的白细胞介素-15。
7、在一些实施例中，提取靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡包括：将所述α-mem培养基中血清成分替换成无外泌体血清成分培养所述car-nk细胞；收集含所述car-nk细胞的上清液进行离心、重悬，得到所述靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡。
8、在一些实施例中，所述利用所述靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡装载内容物中内容物包括穿孔素。
9、本发明的第二方面，提供一种靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡，该细胞外囊泡通过所述一种制备靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡的方法制得。
10、本发明的第三方面，提供一种靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡在制备肿瘤治疗药物中的应用。
11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
12、本发明提供的car-nk-ev制备方法能够制得靶向肿瘤细胞dr5的药物。该药物对肿瘤微环境的抑制性不敏感，提高了肿瘤穿透率，也减少了肿瘤治疗药物的注射量，避免了固有免疫被激发等潜在危险，有效减弱了药物的毒副作用。此外，car-nk-ev可促进car-nk细胞的肿瘤浸润及功能活化，为现有car-nk疗法提供了一种新的实体瘤治疗辅助治疗手段。与此同时，通过对car-nk细胞膜结构进行功能化修饰，装载了ccr2-irgd，提高了该细胞分泌的car-nk-ev对具有dr5靶点的肿瘤的摄取率。不仅如此，car-nk-ev作为药物载体具有广泛适用性，能够包载穿孔素、rna等多种内容物。进一步地，本发明通过调控car-nk细胞rab27基因的表达，提高了car-nk-ev的产量。
1.一种制备靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤s12中，感染复数为5。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤s2前还包括在所述car-nk细胞上装载ccr2-irgd模块，具体包括：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤s2前还包括在所述car-nk细胞上装载rab27模块，具体包括：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤s2包括利用α-mem培养基培养所述car-nk细胞；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤s3包括：
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s3后还包括：
9.一种靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡，其特征在于所述靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡根据权利要求1-9所述方法制得。
10.权利要求9所述的靶向肿瘤细胞死亡受体5的细胞外囊泡在制备肿瘤治疗药物中的应用。
