本发明涉及临床医学、生物医学和医学检验，具体地说，是一种生物标记物用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的用途及其筛选方法。
背景技术：
1、甲状腺癌的发病率在全球范围内不断上升，其中甲状腺乳头状癌占80％以上。超声诊断是目前常用筛查的方法，但部分患者存在着超声诊断灰区，需要细针穿刺细胞学方法来评估良性或恶性甲状腺乳头状癌。因此，建立一种适用于早期诊断甲状腺乳头状癌的非侵入性敏感方法具有临床应用前景。
2、本课题组开发了一种新型高通量定量血浆蛋白质组学方法，用于发现血液中的甲状腺乳头状癌诊断的早期蛋白生物标志物。分别用训练队列和验证队列对识别的生物标志物候选进行评估。本课题组通过高通量蛋白组学筛选出血浆中1063种蛋白质，其中129种蛋白质在患者和健康对照组人群之间存在表达差异，尤其是isg15、plxnb2与健康供者相比，甲状腺乳头状癌患者血清isg15和plxnb2水平显著升高。
技术实现思路
1、本发明公开了一种生物标记物用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的用途及其筛选方法，应用高通量定量血浆蛋白质组学方法建立一种生物标记物，并通过检测isg15和plxnb2蛋白用于诊断甲状腺癌的方法建立和应用。针对现有技术的不足之处，本发明的第一目的是建立一种用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的生物标记物的筛选方法，第二目的是公开了一种生物标记物用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的用途，评价isg15和plxnb2蛋白作为血浆生物标记物在甲状腺乳头状癌临床诊断中的应用。
2、为实现上述第一目的，本发明通过tmt-16plex标记法从甲状腺乳头状癌细胞(tcp-1)中提取的加标蛋白来增强质谱测量报告离子的敏感性，进而提高定量检测的灵敏度，具有重要的临床使用意义。定量蛋白质组学能够利用生物液体进行发现研究，寻找早期发现甲状腺乳头状癌的蛋白质生物标志物。用健康人混合血浆作为健康对照，与甲状腺乳头癌患者血浆及甲状腺乳头状癌细胞系中提取的蛋白共同进行蛋白组学检测。通过引入从甲状腺乳头状癌细胞系中提取的蛋白，建立高选择性的蛋白组学方法，使筛选出的目标蛋白可以比文献报道高出一倍。创新使用健康人混合血浆作为健康对照，尽可能减少批间误差。
3、为实现上述第二目的，本发明采取的技术方案是：采用独立训练队列和验证队列进行酶联免疫(elisa)评估isg15和plxnb2在甲状腺乳头状癌诊断中的作用。
4、具体地，本发明通过以下技术方案来实现：
5、本发明公开了一种生物标记物用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的用途，所述的生物标记物为timp1、apoe,isg15,vasn和plxnb2。
6、作为进一步地改进，本发明所述的生物标记物为isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的组合。
7、作为进一步地改进，本发明所述的用途包括用于区分是否患有甲状腺乳头状癌。
8、作为进一步地改进，本发明所述的产品通过检测血浆中isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的表达量，来判断甲状腺乳头状癌。
9、作为进一步地改进，本发明所述的产品为包含用于检测isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的组合表达量的试剂。
10、本发明还公开了一种用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的生物标记物的筛选方法，具体包括如下步骤：
11、1)用健康人混合血浆作为健康对照，与甲状腺乳头癌患者血浆及甲状腺乳头状癌细胞系中提取的蛋白，使用tmtprotm16plex试剂标记进行标记，使用过滤柱去除高丰度蛋白，并测定蛋白浓度；
12、2)对过柱的蛋白样本进行烷基化，将烷基化后的蛋白样品转移到含有胰蛋白酶的缓冲液中消化；
13、3)甲酸淬灭蛋白酶活性后，使用真空干燥器干燥，然后将干燥样品溶解在乙腈中，并测定肽浓度；
14、4)取一定量的蛋白质消化物使用tmtprotm16plex标记，利用高效液相色谱系统和反相柱，将标记样品的混合分离成肽段；
15、5)收集的肽段冻干成粉；
16、6)干燥后的肽段在一定浓度甲酸中溶解，进行纳米液相色谱-质谱分析，筛选出timp1、apoe、isg15、vasn、plxnb2，并进行评估和验证；
17、7)引入从甲状腺乳头状癌细胞系中提取的蛋白，建立高选择性的蛋白组学方法，使筛选出的目标蛋白比文献报道高出一倍。
18、作为进一步地改进，本发明所述的评估和验证具体为利用训练队列(75例健康对照样本、75例甲状腺乳腺癌患者样本)对纳米液相色谱-质谱分析得出的前5位蛋白timp1、apoe、isg15、vasn、plxnb2进行进一步酶联免疫吸附验证，统计发现其在甲状腺乳头状癌的诊断中有统计学差异，尤其是isg15和plxnb2蛋白的表达差异最显著。在训练队列中，正常对照组与甲状腺乳头状癌isg15的auc诊断效能为0.783，plxnb2的auc诊断效能为0.858，isg15联合plxnb2的auc诊断效能为0.884。在验证队列中，正常对照组与甲状腺乳头状癌isg15的auc诊断效能为0.802，plxnb2的auc诊断效能为0.841，isg15联合plxnb2的auc诊断效能为0.856。
19、作为进一步地改进，本发明所述的评估和验证具体还包括：对筛选出来的isg15和plxnb2蛋白，进一步利用验证队列(65例健康对照样本、65例甲状腺乳腺癌患者样本)对isg15和plxnb2的诊断效能进行评估和验证，统计发现甲状腺乳头状癌和正常对照相比，甲状腺乳头状癌患者血清isg15和plxnb2水平显著升高(p<0.001)，isg15联合plxnb2的auc诊断效能为0.872。
20、本发明优点在于：
21、1、本发明建立新型高通量定量血浆蛋白质组学，创新加入从甲状腺乳头状癌细胞中提取的加标蛋白来增强质谱测量报告离子的敏感性，该体系能够量化的蛋白质数量超过以往发表研究的两倍。
22、2、本发明通过基因富集分析发现血浆中isg15和plxnb2与甲状腺癌的发生发展密切相关。
23、3、本发明采用独立训练队列和验证队列利用酶联免疫吸附方法对isg15和plxnb2的诊断效能进行评估和验证，roc分析在训练和验证队列中能显著区别甲状腺乳头状癌及对照组，isg15与plxnb2联合使用对ptc的早期检测效果更好(auc＝0.872)。
24、4、本发明的isg15和plxnb2可采用血浆样本检测，样本易于获得，创伤性小，可操作性强。
1.一种生物标记物用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的用途，其特征在于，所述的生物标记物为timp1、apoe,isg15,vasn和plxnb2。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的生物标记物为isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的组合。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的用途包括用于区分是否患有甲状腺乳头状癌。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的产品通过检测血浆中isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的表达量，来判断甲状腺乳头状癌。
5.根据权利要求2或4所述的用途，其特征在于，所述的产品为包含用于检测isg15或plxnb2或isg15和plxnb2的组合表达量的试剂。
6.一种用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的生物标记物的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的生物标记物的筛选方法，其特征在于，所述的评估和验证具体为利用训练队列对纳米液相色谱-质谱分析得出的前5位蛋白timp1、apoe、isg15、vasn、plxnb2进行进一步酶联免疫吸附验证，统计发现其在甲状腺乳头状癌的诊断中有统计学差异，尤其是isg15和plxnb2蛋白的表达差异最显著。
8.根据权利要求6或7所述的用于制备表征甲状腺乳头状癌产品的生物标记物的筛选方法，其特征在于，所述的评估和验证具体还包括：对筛选出来的isg15和plxnb2蛋白，进一步利用验证队列对isg15和plxnb2的诊断效能进行评估和验证，统计发现甲状腺乳头状癌和正常对照相比，ptc或甲状腺腺瘤患者血清isg15和plxnb2水平显著升高(p<0.001)，isg15联合plxnb2的auc诊断效能为0.872。
