本发明属于基因工程，具体涉及一种大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体pma及pmk，并进一步公开其构建方法与应用。
背景技术：
1、穿梭质粒是一类具有两种不同复制起点和选择标记基因的质粒，因而可以在多种宿主下进行复制。穿梭质粒通常能够在酵母、哺乳动物或者枯草等细胞中复制，同时也能够在大肠杆菌中进行复制。由于酿酒酵母具有非常好的同源重组能力，利用酿酒酵母体内高效的同源重组系统来实现多个具有末端重叠序列的dna片段的一步组装方法称为转化耦连重组技术(transformation-associated recombination，tar)。酿酒酵母细胞因为其体内高效的同源重组系统而被广泛用于大片段dna的组装中，但是由于在酵母细胞中抽提质粒存在困难，主要表现为产量低、质量差，所以一般都会选择将质粒穿梭于大肠杆菌进行富集。然而商业化的pcc1载体即使在大肠杆菌中的产量也是极低的，小量抽提更是难以满足日常的科研要求。
2、大片段dna分子的合成对生物学的发展具有重大意义，如今越来越多的科研人员都表现出了对大片段dna合成的兴趣。而大片段合成最关键的步骤就是中间片段的组装，这一步通常采用体内同源重组的方法来完成。大肠杆菌和酵母是目前最常用的体内同源重组的工具，大肠杆菌中的red/rec重组系统和酵母中的tar系统用于拼接最终结构均非常有效，但酵母的重组效率却要高于大肠杆菌。但一般情况下，穿梭质粒在酵母中是呈现为单拷贝的，需要将质粒再转化进入大肠杆菌进行富集。目前通常所使用的穿梭质粒均带有一个低拷贝的ori，即使在转化大肠杆菌之后，进行质粒的富集也较为困难，需要大量抽提才能满足科研要求，不但增加了生产成本，而且抽提的质粒质量也较差。
3、传统大片段dna的从头合成大致包括三个步骤，首先是通过两轮的多重重叠pcr，将具有首尾具有碱基互补配对重复区的60-80bp的oligos拼接起来，得到600-800bp的一级片段；随后根据实际情况，采用如gibson组装，golden gate组装等合适的方法将一级片段拼接成5kb左右的二级片段。最后利用酵母体内重组系统拼接成最终的dna片段，该方案最后的拼接至关重要。
4、目前，dna克隆与组装技术随着合成生物学的发展也在不断的升级，最传统的利用ⅱ型限制性酶切位点获得dna片段进行酶切连接克隆的方法仍发挥着重要的作用。但是，因为酶切位点的局限性，这方法并不适用于多片段的组装以及大片段dna的组装，包括依赖于同尾酶的biobrick技术以及依赖ⅱs型酶切位点的golden gate cloning技术都具有此种局限性。基于同源重组原理的gibson assembly技术也称无缝克隆技术，但是随着片段数的增多，其成功率也在在下降，成本也较高，并且一般的puc载体装载能力不强，对于片段较大的构建，成功率很低。
技术实现思路
1、为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体在保证插入片段稳定的前提下，产量获得了极大的提升；
2、本发明所要解决的第二个技术问题在于提供所述穿梭质粒载体的构建方法及应用。
3、为解决上述技术问题，本发明所述的一种大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体包括酵母菌自主复制序列cen、大肠杆菌复制起始位点低拷贝ori、高拷贝ori、以及质粒筛选标记ura3。
4、具体的，所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体pma由amp-ori基因、oris-repe基因、cen/ars基因和ura3进行环形组装获得，所述穿梭质粒载体记为pma。
5、具体的，所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体pma的核苷酸序列如seq id no.5所示。
6、具体的，所述穿梭质粒载体由kanr-ori基因、oris-repe基因、cen/ars基因和ura3进行环形组装获得，所述穿梭质粒载体记为pmk。
7、具体的，所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体pmk的核苷酸序列如seq id no.20所示。
8、本发明还公开了一种所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体的构建方法，包括取选定序列结构的cen基因、低拷贝ori基因、高拷贝ori基因及ura3基因进行环形组装的步骤。
9、本发明还公开了一种由所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体构建的重组质粒。
10、具体的，所述重组质粒的外源插入片段装载量为3-50kbp。
11、具体的，所述重组质粒包括：
12、一种pma-3k重组质粒，所述pma-3k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.6所示；和/或，
13、一种pmk-8k重组质粒，所述pmk-8k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.7所示；和/或，
14、一种pma-14k重组质粒，所述pma-14k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.8-9所示；和/或，
15、一种pma-20k重组质粒，所述pma-20k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.10-11所示；和/或，
16、一种pma-32k重组质粒，所述pma-32k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.12-14所示；和/或，
17、一种pma-50k重组质粒，所述pma-50k重组质粒的核苷酸序列如seq id no.15-18所示。
18、本发明还公开了所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体或所述的重组质粒在酵母菌中进行穿梭、消除、表达或基因编辑中的应用。
19、本发明所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体pma包括酵母菌自主复制序列cen、大肠杆菌复制起始位点低拷贝ori、高拷贝ori以及质粒筛选标记ura3，通过增加一个高拷贝的ori，在保证插入片段稳定的情况下，极大的提升了质粒的产量。
20、本发明所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，尤其适用于基于酿酒酵母体内同源重系统的dna片段进行一步组装的转化耦连技术，在装载3-50kb目的dna时表现出较高的稳定性和成功率，且质粒拷贝数高，易于制备质粒，能够满足正常的科研与工业需求。
1.一种大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒载体包括酵母菌自主复制序列cen、大肠杆菌复制起始位点低拷贝ori、高拷贝ori、以及质粒筛选标记ura3。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒载体由amp-ori基因、oris-repe基因、cen/ars基因和ura3进行环形组装获得，所述穿梭质粒载体记为pma。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体pma，其特征在于，所述穿梭质粒载体pma的核苷酸序列如seq id no.5所示。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒载体由kanr-ori基因、oris-repe基因、cen/ars基因和ura3进行环形组装获得，所述穿梭质粒载体记为pmk。
5.根据权利要求4所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体，其特征在于，所述穿梭质粒载体pmk的核苷酸序列如seq id no.20所示。
6.一种如权利要求1-5任一项所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体的构建方法，包括取选定序列结构的cen基因、低拷贝ori基因、高拷贝ori基因及ura3基因进行环形组装的步骤。
7.一种由权利要求1-5任一项所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体构建的重组质粒。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的外源插入片段装载量为3-50kbp。
9.根据权利要求7或8所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括：
10.权利要求1-5任一项所述大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒载体或者权利要求7-9任一项所述的重组质粒在酵母菌中进行穿梭、消除、表达或基因编辑中的应用。
