本发明涉及抗体制备，特别涉及抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用。
背景技术：
1、甲胎蛋白(alpha fetoprotein，afp)是一种血清糖基化蛋白，这种蛋白正常情况下在胎儿发育的过程中开放表达，主要由胎儿干细胞及卵黄囊合成，在胎儿的血液中具有较高浓度，出生2-3个月内逐渐由白蛋白替代。因此甲胎蛋白在成人血清中含量极低，一般不到20μg/l。甲胎蛋白是一种重要的细胞内信号分子，参与各种细胞过程，其中包括运输功能、作为生长调节因子的双向调节功能、免疫抑制、t淋巴细胞诱导凋亡等。afp和pten的相互作用抑制pten对pi3k/akt通路的抑制功能，导致肝癌细胞异常增殖。此外，afp和半胱天冬酶-3的相互作用阻断了半胱天冬酶-3信号传导，从而抑制了凋亡信号通路。afp也会竞争性地与类视黄酸受体(rar)结合，抑制atra-rar复合物的形成和rar的核易位，上调存活蛋白的表达，下调gadd153、fn14和gadd45a的表达，导致细胞凋亡减少。afp还可以通过增加k19、epcam、mmp2/9和cxcr4等细胞迁移相关基因的表达来促进肝癌细胞迁移和侵袭。这些数据表明，afp干扰正常的信号网络，并通过与不同的信号蛋白结合导致肿瘤发生。
2、甲胎蛋白与癌症及多种肿瘤的发生发展密切相关，因此临床上多将甲胎蛋白用于多种肿瘤的阳性检测指标。例如，当肝细胞发生癌变时，afp由肝癌细胞再次分泌产生，约有70％的肝癌患者血清中甲胎蛋白会升高，因此甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性血清标志物，广泛用于肝癌的筛查、诊断、疗效评价和复发评估，是早期诊断原发性肝癌最敏感、最特异的指标，适用于大规模普查。另外，甲胎蛋白对于监测生殖系肿瘤如睾丸肿瘤发展及活动同样具有重要意义，在睾丸非精原细胞瘤的诊断和治疗效果评价中是较为敏感的指标。甲胎蛋白对于妇产科的生殖腺胚胎癌、卵巢内胚窦癌的诊断也具有较高的指导意义。此外，afp中度升高也常见于酒精性肝硬化、急性肝炎以及hbsag携带者。某些消化道癌也会出现afp升高现象。孕妇血清或羊水afp升高提示胎儿脊柱裂、无脑症、食管atresia或多胎，afp降低(结合孕妇年龄)提示未出生的婴儿有down’s综合征的危险性。基于afp在多种疾病的临床诊断和监测方面所表现出的突出特性，其血清检测对早期临床诊断和长期治疗具有重要价值。
3、近年来，免疫检测如酶联免疫吸附(elisa)法被开发并广泛用于定量测量血浆、血清、细胞裂解物和培养上清液以及组织样品中的甲胎蛋白水平，其核心技术是特异性识别afp的抗体。但现阶段市面上的afp体外elisa试剂盒伴有抗体亲和力较低、检测灵敏度较差的缺点。因此，开发高亲和力和高特异性的单克隆抗体对于提高免疫检测afp的特异性、准确度和灵敏度具有十分重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
2、为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
3、本发明第一方面提供了一种抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区(cdr)；其中：所述第一抗体的轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.3-5所示，重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.8-10所示；所述第二抗体的轻链cdr1、轻链cdr2和轻链cdr3的氨基酸序列分别如seq id no.13-15所示，重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3的氨基酸序列分别如seq idno.18-20所示。
4、进一步地，所述第一抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示；所述第二抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.12所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.17所示。
5、进一步地，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；其中：所述第一抗体的所述轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述重链的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述第二抗体的所述轻链的氨基酸序列如seq id no.11所示，所述重链的氨基酸序列如seq id no.16所示。
6、本发明第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
7、进一步地，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.21所示，重链可变区的核苷酸序列如seq id no.22所示；所述第二抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.23所示，重链可变区的核苷酸序列如seq id no.24所示。
8、本发明第三方面提供了一种重组载体或宿主细胞，包含编码如上所述的第一抗体和/或第二抗体的核酸分子。
9、本发明第四方面提供了如上所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体、如上所述的核酸分子、如上所述的重组载体或宿主细胞在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用。
10、本发明第五方面提供了一种免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的第一抗体和/或第二抗体。
11、进一步地，所述试剂盒为酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫组织化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫印迹试剂盒或流式细胞试剂盒。
12、进一步地，免疫检测样本包括血浆、血清、细胞裂解物、细胞培养液和组织样本中天然表达的甲胎蛋白以及重组表达的甲胎蛋白。
13、进一步地，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述试剂盒包括所述第一抗体和所述第二抗体，其中，所述第一抗体为捕获抗体，经可检测标记偶联的所述第二抗体为检测抗体。
14、本发明的优点及积极效果为：
15、本发明制备得到具备上述cdr序列的兔单克隆抗体可以特异性识别和结合血浆、血清、细胞裂解物和细胞培养液以及组织样本中的天然甲胎蛋白以及重组表达的甲胎蛋白，具有亲和力高、特异性好等特点，且第一抗体和第二抗体分别识别和结合人afp蛋白不同的抗原表位，以二者配对建立双抗夹心酶连免疫吸附检测体系，具有特异性高、准确性好、抗干扰能力强、检测灵敏度高等优点，检测人afp蛋白的检测限低至0.001ng/ml，可实现检测样本中痕量人afp蛋白的高精度检测，在afp表达水平异常相关疾病的临床诊断、预后判断和疗效监测方面等具有良好的应用前景。
1.一种抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体为第一抗体或第二抗体，所述兔单克隆抗体包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区和所述重链可变区均包括3个互补决定区；其中：
2.根据权利要求1所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述第一抗体的所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述重链可变区的氨基酸序列如seqid no.7所示；
3.根据权利要求1所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体还包括轻链恒定区和重链恒定区，所述轻链恒定区和所述轻链可变区构成轻链，所述重链恒定区和所述重链可变区构成重链；其中：
4.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-3任一项所述的第一抗体和/或第二抗体。
5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述第一抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.21所示，重链可变区的核苷酸序列如seq id no.22所示；
6.一种重组载体或宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求4-5任一项所述的核酸分子。
7.如权利要求1-3任一项所述的抗人甲胎蛋白的兔单克隆抗体在制备免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒中的应用。
8.一种免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-3任一项所述的第一抗体和/或第二抗体。
9.根据权利要求8所述的免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为酶免疫分析试剂盒、酶联免疫吸附试剂盒、酶联免疫斑点试剂盒、免疫组织化学试剂盒、免疫荧光试剂盒、免疫印迹试剂盒或流式细胞试剂盒；
10.根据权利要求8所述的免疫检测人甲胎蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒，所述双抗夹心酶联免疫吸附试剂盒包括所述第一抗体和所述第二抗体，其中：
