本发明涉及一种光皮肤鳞癌控基因复合材料，尤其是涉及一种基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法及其应用。
背景技术：
1、皮肤鳞状细胞癌(scc)是一种非黑色素瘤皮肤癌和角质形成细胞癌，起源于表皮角质形成细胞不受控制的增殖，是表皮内长期持续的发育不良过程的结果。虽然scc很少发生转移，但它促使局部皮肤、软组织、软骨和骨骼破坏。scc占皮肤恶性肿瘤的20％，占所有皮肤癌(不包括黑色素瘤)死亡的75％，且近年发病率不断增加。
2、癌症治疗方法有多种，其中化学疗法最常见、运用最普遍。化学疗法有一定临床疗效，但作为一种全身性治疗方法，其靶向性相对较差，对正常组织会产生毒副作用，且长期使用会产生耐药性，导致随给药时间增加，药物的治疗效果降低的问题，增大肿瘤治疗难度。作为一种非侵入式治疗，光动力治疗(pdt)副作用低，可实现局部靶向治疗。在pdt中，通过特定波长的激发光照射，光敏剂吸收光子被激发将表面电子传递到周围组织产生活性氧(ros)，ros通过激活细胞损伤、血管破坏和免疫反应介导的细胞凋亡等作用杀伤癌细胞。但是现有pdt中存在ros产量有限，pdt疗效不够理想，且光敏剂靶向性较差，传统的光敏剂价格昂贵治疗成本较高。因此开发更高ros产生效率，具有靶向性且价格更低的光敏剂，成为pdt癌症治疗研究的重点。
3、纳米氧化锌(zno)作为一种价格低廉的光敏剂，由于其良好的生物相容性、结构的丰富性、易改性和良好的性能等特点，使其成为一种优良的药物载体系统。近十年来，各种zno纳米结构以及纳米杂化材料成为药物装载和携带的载体系统，在药物递送平台显示出巨大的应用潜力。因此，研究人员正在使用纳米药物封装光敏剂，该光敏剂可以通过增加靶点的药物输送量来提高pdt疗效，以期改善scc的临床治疗现状。zno虽然具有较高的ros产生效率，但靶向性较差。与稳定性差的化学靶向法和昂贵的生物靶向法相比，磁性靶向法具有操作方便、稳定性强、成本低、能快速引导载体到达目标部位等优点。其中，基于超顺磁性材料的纳米磁性材料，如fe3o4纳米粒子，因其制备方法简单、成本低、易修饰而收到青睐。此外，它们还能在体外实现磁场控制下的靶向定位。因此，利用磁靶向手段将光敏剂引导至目标区域，在临床应用中将具有很大的优势。
4、基因治疗作为一种新兴的治疗方式，是通过导入外源基因片段精准调控细胞内的基因表达，从而达到精确治疗疾病的目的。通过有意调节特定细胞中的基因表达以治疗疾病或病变组织。基因组中的几乎任何序列以及转录组中的每个编码和非编码rna都有可能通过将外源核酸引入细胞来进行调节，以达到治疗目的。鉴于这些大分子的大尺寸和负电荷，使其进入细胞比较困难，且容易被核酸酶降解。因此寻求一种保护核酸进入细胞的递送系统已成为基因治疗的核心。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种安全、精准靶向、高效的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法及其应用，实现了皮肤鳞癌pdt、光控化疗、光控基因治疗的联合治疗。
2、本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，包括以下步骤：
3、(1)将zno包覆fe3o4制备得到fe3o4@zno纳米颗粒；
4、(2)将fe3o4@zno纳米颗粒表面羧基化得到fe3o4@zno-cooh纳米颗粒；
5、(3)将fe3o4@zno-cooh纳米颗粒与rna-hmnb连接得到fe3o4@zno-hmnb-sirna纳米颗粒；
6、(4)将fe3o4@zno-hmnb-rna纳米颗粒均与抗egfr抗体连接得到fe3o4@zno@anti-efgr-sirna纳米颗粒；
7、(5)将溶有鸦胆子苦醇(bru)的丙酮溶液滴加入搅拌中的fe3o4@zno@anti-egfr-sirna水悬浊液中，待丙酮挥发完毕，bru吸附于纳米复合物上，获得载药纳米复合物fe3o4@zno@anti-egfr-sirna-bruncs。
8、进一步，步骤(1)具体为：
9、a.在n2保护下，将5.4349gfecl3·6h2o和2.0184gfecl2·4h2o溶解在25ml去离子水中，然后加入0.57ml浓度为12mol/l hcl，将所得溶液滴入150ml1.5mol/l的naoh溶液中，剧烈搅拌30min，反应完成后，将黑色沉淀从溶液中分离出来，用去离子水洗涤3次，真空干燥得到fe3o4核；
10、b.将0.014gfe3o4核沉淀分散在20ml二甘醇中，超声分散30min后，加入0.05gzn(ac)2·2h2o，剧烈搅拌30min后，160℃油浴1.5h，离心收集沉淀，分别用乙醇和去离子水清洗沉淀3次，真空干燥，得到fe3o4@zno纳米颗粒。
11、进一步，步骤(2)具体为：称取10mgfe3o4@zno纳米颗粒均匀分散于1ml乙醇溶液中，恒温磁力搅拌器上加热，待温度达到50℃时，滴加37.35mg的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮，50℃下恒温搅拌反应7h，反应结束后，离心弃上清，无水乙醇洗涤三次，真空干燥，将干燥后的纳米颗粒加入1ml三蒸水，80℃反应2h，离心得到羧基化的fe3o4@zno纳米颗粒。
12、进一步，步骤(3)具体为：
13、a.光解链hmnb与nrf2-sirna连接
14、将3mg的hmnb在25℃下溶解在50μl的n-甲基吡咯烷酮(nmp)中，加入5mg o-(苯并三唑-1-基)-n,n,n,n-四甲基脲六氟磷酸季铵盐(hbtu)、2mg 1-羟基苯并三唑(hobt)、5μln-乙基二异丙胺(diea)并搅拌5min，然后加入50μl溶有1nmol nrf2(核因子e2相关因子)-sirna(5′-uaauugucaacuacugucaguu-3′)的nmp溶液，常温下搅拌反应8h，0℃的冰乙醚沉淀产物，分离沉淀的产物得到rna-hmnb；光解链hmnb(4-[4-(1-羟乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸)在365nm的uva照射下其不稳定酯键发生断裂，从而释放出连接在fe3o4@zno纳米颗粒(fe3o4@zno nps)上的nrf2-sirna；
15、b.fe3o4@zno-cooh纳米颗粒与rna-hmnb连接
16、将10mg的fe3o4@zno-cooh纳米颗粒在n2气氛下加入到1ml含有28mgn,n'-二环己基碳二亚胺(dcc)和16mg 4-二甲氨基吡啶(dmap)的无水二甲基亚砜(dmso)中进行预活化，然后滴加1ml含有2mg rna-hmnb的无水dmso，常温下搅拌反应2h，反应完成后离心收集沉淀，无rna酶水洗涤沉淀2次，冻干产物，得到fe3o4@zno-hmnb-rna纳米颗粒。
17、进一步，步骤(4)具体为：将0.012g的fe3o4@zno-hmnb-rna纳米颗粒均匀分散在5ml无rna酶水中，加入1.25mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc)和0.75mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，搅拌30min，将0.1mg抗egfr抗体添加到混合物中，37℃反应过夜，将反应产物离心收集，无rna酶水洗涤2次，离心后冻干，即得到fe3o4@zno@anti-efgr-sirna纳米颗粒。
18、进一步，步骤(5)中所述的fe3o4@zno与所述的鸦胆子苦醇的质量比为(100～1):1。
19、上述方法制备得到的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料在制备抗皮肤鳞癌药物方面的应用。
20、与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法及其应用，将nrf2-sirna通过光降解链hmnb接枝到fe3o4@zno表面，同时将抗egfr抗体接枝在fe3o4@zno纳米颗粒表面，实现生物靶向和磁靶向的双重靶向，使fe3o4@zno表面装载的药物准确释放到肿瘤部分，提高抗癌效果的同时减少对正常组织的损伤，最后将抗癌药bru负载在其表面，合成了fe3o4@zno@anti-egfr-sirna-bru载药载基因的纳米复合物；该载药光敏剂具有uva响应性，当抗egfr抗体精准识别癌细胞后，在uva照射下，释放bru的同时，光解链hmnb断裂释放nrf2-sirna，抑制nrf2的rna基因转录，进一步降低肿瘤细胞的活性氧清除能力，进一步提高对皮肤鳞癌的治疗效果，从而实现pdt、光控化疗和光控基因治疗的联合治疗，对scc具有协同增效的作用，提高了scc的疗效。
1.基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于步骤(1)具体为：
3.根据权利要求2所述的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于步骤(2)具体为：称取10mgfe3o4@zno纳米颗粒均匀分散于1ml乙醇溶液中，恒温磁力搅拌器上加热，待温度达到50℃时，滴加37.35mg的二氢-3-[3-(三乙氧基硅基)丙基]呋喃-2,5-二酮，50℃下恒温搅拌反应7h，反应结束后，离心弃上清，无水乙醇洗涤三次，真空干燥，将干燥后的纳米颗粒加入1ml三蒸水，80℃反应2h，离心得到羧基化的fe3o4@zno纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于步骤(3)具体为：
5.根据权利要求4所述的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于步骤(4)具体为：将0.012g的fe3o4@zno-hmnb-rna纳米颗粒均匀分散在5ml无rna酶水中，加入1.25mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和0.75mgn-羟基琥珀酰亚胺，搅拌30min，将0.1mg抗egfr抗体添加到混合物中，37℃反应过夜，将反应产物离心收集，无rna酶水洗涤2次，离心后冻干，即得到fe3o4@zno@anti-efgr-sirna纳米颗粒。
6.根据权利要求5所述的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的fe3o4@zno与所述的鸦胆子苦醇的质量比为(100～1):1。
7.一种权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到的基于氧化锌的皮肤鳞癌pdt-光控化疗-光控基因治疗复合材料在制备抗皮肤鳞癌药物方面的应用。
