本发明涉及一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导的电化学适配体传感器检测赭曲霉毒素a(ota)的制备方法及应用。
背景技术：
1、赭曲霉毒素是一种由曲霉属和青霉属真菌产生的次级代谢产物，是一种典型的生物毒素，研究表明，在目前已知的六种赭曲霉毒素中，ota的毒性最大，具有肾毒性、肝毒性、胚胎毒性、致畸性、神经毒性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性。国际癌症研究机构(intemationalagency forresearchon cancer，iarc)在几项动物研究中发现的大量致癌性证据，将ota列为可能的人类致癌物(2b类)。ota产毒菌株种类繁多且无处不在，且性质非常稳定，不容易代谢，目前，已发现其对水果制品、谷物、咖啡豆、茶叶、草药、畜产品(肉、蛋、奶制品)等具有特殊的侵染力，导致多种食品安全问题。
2、通常ota的含量很低，所以对检测手段的要求较高，检测ota的方法有微柱法，定量分析方法有薄层色谱法、高效薄层色谱法、hplc、酶联免疫吸附法和荧光比色法等。但是目前已知的方法中均存在不足，如薄层层析法灵敏度较差、检测周期长以及重现性不好；色谱法仪器昂贵，操作复杂且不适合用于大批量样品的检测；酶联免疫吸附法基于抗原-抗体的亲和反应，以抗体作为识别分子，但是抗体容易受到外界环境尤其是温度的影响，限制了方法的灵活应用，并且，抗体制备也需经过动物实验或者细胞实验，繁琐费时，制备成本高，检测的成本也高。所以有必要发展一种快速方便，灵敏准确的新型检测方法。
3、电化学传感器进行定量分析时具备灵敏度高、仪器操作简单、成本较低的优点，但往往存在不稳定的情况。而核酸适配体性质稳定，成本低，具有高亲和力和高选择性，在一定条件下它能够与靶标物质结合，并折叠成特定的二级结构，进而灵敏地检测靶标物质。目前，基于功能性核酸的电化学传感器检测真菌毒素已经成为研究热点。此外，为了进一步提高传感器的灵敏度，开发了一些信号放大策略，常见的有dna放大技术，如杂交链式反应(hcr)、催化发夹自组装(cha)、滚环扩增(rca)等；纳米材料，如金属有机框(mof)、共价有机框架(cof)等。其中，hcr作为一种无酶的等温信号放大方法，设计简单，经济高效，受到了广泛关注，金属有机框架因其可调的纳米尺寸、多样的结构、高孔隙率、导电性好等特点而被应用于电化学检测研究中。它们不仅可以承载电化学信号标签，而且能够提供大量活性位点和高导电性，同样可以起到信号放大的作用。
4、本发明针对现有检测技术存在的问题，引入磁分离技术，降低假阳性信号的干扰；利用高孔隙率的金属有机框架负载高导电性的双金属纳米颗粒，使电极表面连接更多dna链，可有效放大电化学信号；引入金属离子介导的dna酶结合双足dnawalker，实现高效率剪切；发夹2和发夹3在剪切暴露的引发链的作用下进行杂交链式反应，形成长双链dna，吸附大量亚甲基蓝，实现信号的进一步扩增。基于本发明的电化学传感策略在克服了以上现有技术存在问题的同时，具有响应速度快、选择性好、稳定性优，便捷经济的特点，有利于发明的推广应用。
技术实现思路
1、一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，按照以下步骤进行：
2、(1)金属有机框架的制备：采用一锅溶剂热法进行制备，首先将过渡金属氯化物和氨基-苯二甲酸溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，加入乙酸并超声处理。将上述混合溶液转移到高压反应釜中过夜孵育，高速离心收集产物，依次用n,n-二甲基甲酰胺和乙醇冲洗以除去未反应的溶剂，真空干燥至恒重即得过渡金属有机框架纳米材料。
3、(2)金属有机框架负载双金属纳米颗粒的制备：通过原位生长法将在上述金属有机框架上原位生成双金属纳米颗粒。首先将上述金属有机框架分散在水中，超声后加入贵金属溶液a、贵金属溶液b进行充分搅拌，之后加入还原剂充分搅拌30分钟，高速离心，真空干燥至恒重即得双金属纳米复合材料。
4、(3)mbs@w-dna/apt体系的制备：通过适配体链apt上的氨基与磁珠mbs表面包被的羧基之间的强结合作用将适配体负载在mbs上，同时双足dna步行器w-dna与适配体碱基互补配对形成双链结构，磁分离并用缓冲液洗涤，去除上清液后即成功构建mbs@w-dna/apt体系。
5、(4)电化学传感器的构建：向mbs@w-dna/apt体系中添加含ota的标准溶液，ota与适配体结合释放w-dna，经过磁分离后w-dna存在于上清液。取上清液与修饰pb2+特异性剪切位点的发夹链h1混合，w-dna在pb2+的作用下激活pb2+dna酶裂解发夹链h1，发夹链h1被剪切为两条单链使引发杂交链式反应的序列暴露，加入发夹链h2和发夹链h3后，进行杂交链式反应形成长的双链，最后通过引发序列上修饰的基团连接在电极表面，通过浸入亚甲基蓝溶液使双链嵌入大量亚甲基蓝，产生较高电流响应。不存在ota时，w-dna与apt碱基互补配对，经磁分离后于沉淀中，无法使发夹链h1裂解，不能引发杂交链式反应，浸入亚甲基蓝溶液后，产生较低电流响应。
6、(5)ota的电化学检测：电化学适配体传感器以饱和氯化银电极为参比电极，铂丝电极为对电极，通过pbs缓冲溶液中对亚甲基蓝的响应完成对ota的检测，根据测定亚甲基蓝信号与加入ota的浓度之间的关系，绘制相应的线性关系曲线。
7、进一步限定，步骤(1)中，所述的过渡金属氯化物为四氯化锆、氯化铜、氯化镍中的一种或多种。
8、进一步限定，步骤(2)中，所述的贵金属溶液a、贵金属溶液b为四氯金酸、氯铂酸、氯钯酸中的两种。
9、进一步限定，步骤(3)中，所述还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸盐、水合肼中的一种或多种。
10、进一步限定，步骤(4)中，所述的单链w-dna的序列为：5’
11、-tctcttctccgagccggtcgaaatagtcctttacgccactctcttctccgagccggtcgaaatagt-3’；发夹链h1的序列为：5’
12、-ttttttgcccgcatgctaatcgtgacactat/ra/ggaagagatatcgattagcatgc-3’；发夹链h2序列为：5’-atgctaatcgtgagcgcggtcacgattagcatgcgggcgggccc-3’；发夹链h3序列为：5’-ccgcgctcacgattagcatgcccgcatgctaatcgtgacccggg-3’。
13、进一步限定，步骤(3)(4)中，所述的dna链的浓度为4～16μm，所用体积为2.5～5μl，孵育时间为0.5～2.5h。
14、进一步限定，步骤(4)中，所述的发夹链1的一端修饰有与电极表面结合的基团，为生物素、氨基、羧基、巯基中的一种或多种。
15、进一步限定，步骤(3)(4)中，所述的缓冲溶液为tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、pb缓冲液中的一种或多种。
16、与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
17、1.本发明利用ota特异性识别释放w-dna，经磁分离技术可降低体系背景信号，提高电化学传感器的可靠性。
18、2.本发明应用双足dnawalker在pb2+的作用下激活dna酶进行剪切，相比于单足dnawalker有更宽的行走范围和更高的行走动力学，相比于三足dnawalker制备简单，成本较低。
19、3.本发明成功制备出双金属纳米复合材料，为传感器提供大量活性位点和高导电性，实现信号放大。
20、4.本发明将dna链的反应置于离心管内进行，最后一步修饰在电极上，可降低每一步修饰时由于冲洗、温度和湿度产生的误差，同时缩短电极的使用时间。
21、上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下为本发明的较佳实施例详细说明。
1.一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的过渡金属氯化物为四氯化锆、氯化铜、氯化镍中的一种或多种，所述的贵金属溶液a、贵金属溶液b为四氯金酸、氯铂酸、氯钯酸中的两种，所述还原剂为硼氢化钠、抗坏血酸、柠檬酸盐、水合肼中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的单链w-dna的序列为：5’-tctcttctccgagccggtcgaaatagtcctttacgccactctcttctccgagccggtcgaaatagt-3’。
4.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述dna发夹链h1的序列为：5’-ttttttgcccgcatgctaatcgtgacactat/ra/ggaagagatatcgattagcatgc-3’；所述dna发夹链h2序列为：5’-atgctaatcgtgagcgcggtcacgattagcatgcgggcgggccc-3’；所述dna发夹链h3序列为：5’-ccgcgctcacgattagcatgcccgcatgctaatcgtgacccggg-3’。
5.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）（3）中，所述的dna链的浓度为4 ~ 16 μm，所用体积为2.5 ~ 5 μl，孵育时间为0.5 ~ 2.5 h。
6.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的发夹链1的一端修饰有与电极表面结合的基团，为生物素、氨基、羧基、巯基中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种基于zr-mof@aupt和dna酶驱动双足dna步行器介导电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的缓冲溶液为tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液、pb缓冲液中的一种或多种。
