本发明属于基因工程。更具体地，涉及缺失60kda糖蛋白基因的微小隐孢子虫基因缺失虫株及其应用。
背景技术：
1、微小隐孢子虫(cryptosporidium parvum)是重要的顶复门寄生原虫，广泛分布于动物、人和环境中，主要通过粪口途径传播，寄生于动物和人的肠黏膜上皮细胞，感染宿主后导致以消化紊乱和水样腹泻为主要临床症状的隐孢子虫病，严重时引起宿主死亡。隐孢子虫感染率高，对幼龄牛羊的感染率可达70％以上，并由于可以跨种传播感染人，因此对养殖业造成严重危害的同时，也对公共健康造成严重危害。
2、目前对隐孢子虫病的预防和治疗手段十分有限，仅有硝唑尼特被fda批准可用于人类隐孢子虫病临床治疗。硝唑尼特对免疫力正常的成人和1岁以上的儿童隐孢子虫病有治疗作用，然而该药对于患有艾滋病的患者和免疫功能发育不完善的儿童无效。此外，针对隐孢子虫病的预防至今没有良好的疫苗，多肽等亚单位疫苗仅能产生极低的部分免疫保护效果，且还处于科研阶段，目前市场上还未有商品化且有效的隐孢子虫疫苗。同时，由于隐孢子虫很难进行体外连续传代及反向遗传操作，其遗传操作技术长久处于落后状态，导致人们对隐孢子虫入侵和生长发育机制了解不足，因此目前也没有相关疫苗候选分子被研究鉴定。
3、微小隐孢子虫黏蛋白是一类在隐孢子虫中特异性存在并具有大量糖基化修饰的糖蛋白，其中分子量为60kda的糖蛋白(gp60)可能参与隐孢子虫的黏附过程，对隐孢子虫的入侵非常重要；但是受限于基因敲除等技术手段，其具体功能仍不清楚。现有研究通过对gp60重组蛋白的研究及其抗体的制备，显示用于体外识别gp60蛋白的多抗具有阻断微小隐孢子虫入侵宿主细胞的能力(崔朝辉.微小隐孢子虫gp60蛋白重组表达及相关生物学功能的初步研究[d].河南农业大学,2016.)，但该研究并未揭示gp60蛋白在微小隐孢子虫中的功能，是否可以将其作为疫苗靶点也是未知的，也无法得知gp60蛋白与虫体毒力之间的关系。由于目前十分缺乏能够用于防治隐孢子虫的疫苗或基因缺失虫株，所以有必要研发出更多的具有预防隐孢子虫感染的基因缺失虫株或疫苗，为防治隐孢子虫提供更多的方法和技术支持。
技术实现思路
1、本发明要解决的技术问题是克服现有防治隐孢子虫感染的基因缺失虫株或疫苗的不足，提供缺失60kda糖蛋白基因的微小隐孢子虫基因缺失虫株及其应用。
2、本发明的第一个目的是提供一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株的构建方法。
3、本发明的第二个目的是提供微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因的应用。
4、本发明的第三目的是提供一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株。
5、本发明的第四目的是提供微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株的应用。
6、本发明的第五目的是提供一种微小隐孢子虫疫苗。
7、本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8、本发明提供一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株的构建方法，使用crispr/cas9基因编辑技术对微小隐孢子虫60kda糖蛋白gp60基因进行敲除，从而获得微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株；所述60kda糖蛋白gp60基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
9、具体包含以下步骤：
10、s1.以pact::cas9-gfp-u6::sgtk质粒为模板，采用gp60基因sgrna引物，构建双sgrna crispr质粒pact::cas9-u6::sggp601-u6::sggp602；
11、s2.以uprt-mch-nluc-p2a-neo-uprt质粒和野生型微小隐孢子虫株的gdna为模板，采用gp60基因引物，构建同源重组质粒gp60-mch-nluc-p2a-neo-gp60；
12、s3.将双sgrna crispr质粒与同源重组质粒共转染至野生型微小隐孢子虫株中，通过药物筛选、pcr鉴定，获得微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株。
13、本发明采用crispr/cas9技术对微小隐孢子虫的60kda糖蛋白gp60基因进行直接敲除，成功获得了gp60基因缺失虫株；并首次发现gp60基因与虫体毒力相关，gp60基因缺失虫株在ifn-γ敲除(gko)小鼠体内的感染强度与毒力显著降低。本发明通过比较标记虫株与缺失虫株体外生长情况及体内感染中卵囊排泄强度等指标，显示在体外生长状况下，gp60基因缺失虫株生长缓慢；在体内生长状况下，虫株荷虫量显著降低，且gko小鼠卵囊排泄强度显著下降，并且不导致感染小鼠的死亡，可以作为一种新的疫苗候选虫株用于制备微小隐孢子虫疫苗。
14、优选地，步骤s1中采用的gp60基因sgrna引物序列如seq id no：2～9所示。
15、优选地，步骤s2中采用的gp60基因引物序列如seq id no：10～17所示。
16、优选地，步骤s3中野生型微小隐孢子虫为微小隐孢子虫iida20g1亚型虫株。
17、作为一种优选地实施方案，本发明提供更加具体的微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株的构建方法：
18、(1)出发虫株采用具有60kda糖蛋白基因的簇虫目隐孢子虫科隐孢子虫属的野生型微小隐孢子虫iida20g2r1亚型虫株，60kda糖蛋白gp60基因的核苷酸序列如seq id no：1所示；
19、(2)双sgrna crispr质粒pact::cas9-u6::sggp601-u6::sggp602的构建：以pact::cas9-gfp-u6::sgtk质粒为模板，利用上下游引物扩增，将tk靶点特异性的sgrna替换为60kda糖蛋白的靶点特异的sgrna1，使用同源重组原理连接，后转化至dh5α，得到pact::cas9-u6::sggp601质粒；以相同方法构建pact::cas9-u6::sggp602质粒。之后以gp60 crispr1质粒为模板，用引物对质粒骨架进行扩增；随后再以gp60 crispr2质粒为模板，对sgrna片段进行扩增，最终构建质粒pact::cas9-u6::sggp601-u6::sggp602；
20、(3)gp60-mch-nluc-p2a-neo-gp60同源重组质粒的构建：由60kda糖蛋白基因的5’同源臂和3’同源臂，表达自发红色荧光蛋白mcherry的完整阅读编码框proac-mch-terac序列，以及药物筛选基因neo，荧光素酶值测定基因nluc连接所得。具体为：以出发虫株微小隐孢子虫iida20g1亚型虫株的基因组为模板，设计引物，扩增gp60-5’utr和gp60-3’utr，从携带有proac-mch-terac的质粒中扩增获得proac-mch-terac片段，从携带有neo以及nluc的质粒中扩增以获得neo和nluc片段，通过pcr扩增将puc19载体线性化，使用多片段连接酶exnasetm multis进行连接以构建重组质粒gp60-mch-nluc-p2a-neo-gp60；
21、(4)微小隐孢子虫基因缺失虫株δgp60的获得：将步骤(1)中虫体卵囊脱囊后子孢子悬液与步骤(2)中得到的pact::cas9-u6::sggp601-u6::sggp602质粒以及步骤(3)得到的pact::cas9-u6::sggp601-u6::sggp602质粒混匀后通过电转染至野生型微小隐孢子虫株中制得微小隐孢子虫基因缺失虫株δgp60。
22、本发明提供缺失或敲除微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因的试剂在构建gp60基因缺失虫株或在制备微小隐孢子虫疫苗中的应用。
23、本发明提供微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因作为靶点在筛选或制备预防微小隐孢子虫感染的药物中的应用。
24、本发明提供一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株，由上述方法构建得到。
25、本发明还提供微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株在制备微小隐孢子虫疫苗中的应用。
26、另外，本发明提供一种微小隐孢子虫疫苗，含微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株。
27、优选地，所述疫苗为弱毒疫苗。
28、本发明具有以下有益效果：
29、本发明提供一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株及其构建方法和应用，通过基因编辑技术缺失60kda糖蛋白gp60基因成功构建微小隐孢子虫基因缺失虫株。本发明首次发现gp60基因与虫体毒力相关，gp60基因缺失虫株在ifn-γ敲除(gko)小鼠体内的感染强度与毒力显著降低，且gp60的缺失影响虫体无性生殖阶段的后期，并严重影响微小隐孢子虫的毒力。研究显示，在野生型微小隐孢子虫iida20g1亚型虫株缺失gp60基因后，仍然可以体外培养，其体外生长荷虫量明显降低，在小鼠体内荷虫量也显著降低，卵囊排泄强度明显减弱，不会造成感染后gko小鼠死亡，具有毒力显著减弱的优点，能够用于制备微小隐孢子虫弱毒疫苗，以用于预防微小隐孢子虫感染。
1.一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株的构建方法，其特征在于，使用crispr/cas9基因编辑技术对微小隐孢子虫60kda糖蛋白gp60基因进行敲除，从而获得微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株；所述60kda糖蛋白gp60基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，具体包含以下步骤：
3.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤s1中gp60基因sgrna引物序列依次如seq id no：2～9所示。
4.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤s2中gp60基因引物序列依次如seqid no：10～17所示。
5.根据权利要求2所述构建方法，其特征在于，步骤s3中野生型微小隐孢子虫株为微小隐孢子虫iida20g1亚型虫株。
6.缺失或敲除微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因的试剂在构建gp60基因缺失虫株或在制备微小隐孢子虫疫苗中的应用，其特征在于，所述微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因作为靶点在筛选或制备预防微小隐孢子虫感染的药物中的应用，其特征在于，所述微小隐孢子虫60kda糖蛋白基因的核苷酸序列如seq id no：1所示。
8.一种微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株，其特征在于，由权利要求1～4任一所述方法构建得到。
9.权利要求8所述微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株在制备微小隐孢子虫疫苗中的应用。
10.一种微小隐孢子虫疫苗，其特征在于，含权利要求8所述微小隐孢子虫gp60基因缺失虫株。
