本发明属于生物工程，具体涉及一种能够高产吲哚-3-乳酸的基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术：
1、色氨酸分解代谢主要有犬尿氨酸、5-羟色胺和吲哚途径三种，其中吲哚代谢途径仅存在于微生物中。吲哚及其衍生物是目前研究的热点，其参与机体各个系统功能的调节，维持机体健康。吲哚-3-乳酸(indole-3-lactic acid，ila)是色氨酸吲哚代谢途径的一环，被发现具有抗炎、抗癌、维持肠道稳态的作用。
2、单纯d-乳酸脱氢酶只能催化ila前体转化为ila，而无法以色氨酸为原料进行制备，成本较高，使用纯酶在体外化学催化色氨酸制备ila的方法需要多种代谢酶的参与。此外，纯酶具有易失活、不稳定、纯化过程繁琐等不足，虽然可以通过将酶固定化的方法来增强其稳定性和重复利用性，但是这无疑是又增加了生产成本。
3、全细胞催化法是直接利用含有酶的静息细胞催化底物合成制备目的产物，该法使得酶具有更高的稳定性且该制备方法更简单，因此使用静息细胞作为催化剂更符合工业发展的需求。
4、本发明构建了一种新的高产ila的基因工程菌，这种工程菌能够用异丙基-d-硫代半乳糖苷诱导，高效表达乳酸脱氢酶，并直接以色氨酸为底物将其代谢为ila，极大提高ila的生产效率。本发明能够通过全细胞催化法制备ila，为制备ila提供一种新的方法途径。
5、此外，吲哚能与肠道微生物群之间的相互作用进而影响人类健康，ila被报道能通过抑制肠道上皮细胞中ccl2/7的表达，减少结肠炎期间促炎巨噬细胞的聚集，从而缓解dss诱导的结肠炎。此外，ila可以使树突状细胞加速产生白介素-12，激活cd8+t细胞，同时降低cd8+t细胞的胆固醇水平，增强了肿瘤浸润cd8+t细胞功能，从而抑制肿瘤生长。
6、本申请同时提供了上述高产ila的基因工程菌的两种体内应用，进而可通过补充工程菌调控机体健康。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种能够高产ila的基因工程菌及其构建方法和应用。利用该基因工程菌能够实现以色氨酸为底物高效生产ila，提供了一种全新途径。
2、所述基因工程菌为能够表达d-乳酸脱氢酶的大肠杆菌，所述d-乳酸脱氢酶为胞内表达；
3、优选的，所述d-乳酸脱氢酶的基因来源于约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)；
4、进一步的，所述d-乳酸脱氢酶可利用异丙基-d-硫代半乳糖苷诱导高效表达，异丙基-d-硫代半乳糖苷的诱导浓度范围为0～1.0mmol/l，优选浓度为0.5mmol/l。
5、本发明还提供了上述能够高产ila的基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
6、以d-乳酸脱氢酶的编码基因ldha为模板进行pcr扩增，以prsfduet-1质粒为载体，构建带有ldha片段的重组质粒prsfduet-1-ldha；然后将重组质粒prsfduet-1-ldha转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中，筛选阳性克隆以及测序成功获得表达d-乳酸脱氢酶的工程菌bl21/prsfduet-1-ldha。
7、所述的d-乳酸脱氢酶的编码基因ldha的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述d-乳酸脱氢酶的氨基酸序列序列如seq id no.2所示；
8、优选的，所述pcr扩增采用的引物对核苷酸序列为：
9、ldha-f：gctgagccatgggcatgacaaagatttttgcttacg(seq id no.3)；
10、ldha-r：ggacgtggatccttagaacttgttcttgtcca(seq id no.4)；
11、优选的，所述pcr反应程序为：预变性98℃3min；变性98℃15s；退火65℃30s；延伸72℃1min；终止延伸72℃5min，35个循环；
12、优选的，所述prsfduet-1-ldha重组质粒构建方案为：利用ncoi(thermo，fd0578)与bamhi(thermo，fd0054)限制性核酸内切酶切割ldha基因与prsfduet-1质粒得到粘性末端，再利用t4 dna连接酶(thermo，el0011)进行连接得到prsfduet-1-ldha重组质粒。
13、本发明还提供了上述能够高产ila的基因工程菌在代谢色氨酸制备ila中的应用，提供一种生产吲哚-3-乳酸的新方法，包括：将上述任一项所述的基因工程菌制备成纯酶或静息细胞，以色氨酸为底物，以所述纯酶化学催化色氨酸或以所述静息细胞催化色氨酸合成吲哚-3-乳酸。
14、优选地，将高产ila的基因工程菌制备成静息细胞并用于代谢色氨酸制备ila的步骤包括：
15、(1)静息细胞的制备；
16、将上述基因工程菌(bl21/prsfduet-1-ldha)接种至lb培养基中培养，得到产ila的大肠杆菌工程菌的静息细胞；
17、(2)d-乳酸脱氢酶高效表达；
18、将上述产ila的大肠杆菌工程菌的静息细胞接种至含有浓度为0.5mmol/l异丙基-d-硫代半乳糖苷的lb培养基中培养4小时，然后离心收集得到高产ila的大肠杆菌工程菌的静息细胞；
19、(3)ila的制备；
20、将步骤(2)得到的高产ila的基因工程菌(bl21/prsfduet-1-ldha)接种至含有色氨酸的lb培养基，代谢转化生成ila。
21、本发明还提供了上述基因工程菌在制备改善卵巢功能药物中的应用。尤其是在制备抗卵巢早衰药物中的应用。
22、所述药品包括药物载体和/或药学上可接受的辅料；所述药品的剂型包括丸剂、片剂、散剂、胶囊、颗粒剂、混悬剂、注射剂、口服液、灌肠剂或管饲制剂。
23、本发明还提供了上述基因工程菌在制备促进肿瘤免疫治疗药物中的应用。
24、优选的，所述的免疫治疗包括但不限于抗pd-1抗体治疗；
25、优选的，所述的肿瘤包括但不限于结直肠癌、乳腺癌与黑色素瘤。
26、本发明至少具有如下优点及有益效果：
27、本技术通过基因工程手段，使用大肠杆菌el21作为表达系统进行生物制备ila，基因操作变得相对可靠，培养条件简单。本发明使用的质粒prsfduet-1的启动子为传统大肠杆菌的t7诱导型启动子，能够通过添加异丙基-d-硫代半乳糖苷作为诱导剂，有效提高d-乳酸脱氢酶的表达，实现了以色氨酸为底物生产ila，能够增加ila的产生效率。本发明将所制得的基因工程菌应用于卵巢早衰模型，有效保护了卵巢功能，且所提供的基因工程菌在体内还具有促进肿瘤免疫治疗的作用。
1.一种能够高产吲哚-3-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为能够表达d-乳酸脱氢酶的大肠杆菌，所述d-乳酸脱氢酶为胞内表达，编码所述d-乳酸脱氢酶的基因来源于约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)。
2.根据权利要求1所述的能够高产吲哚-3-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法包括：以d-乳酸脱氢酶的编码基因ldha为模板进行pcr扩增，以prsfduet-1质粒为载体，构建带有ldha片段的重组质粒prsfduet-1-ldha；然后将重组质粒prsfduet-1-ldha转化至大肠杆菌bl21感受态细胞中，筛选阳性克隆以及测序成功获得表达d-乳酸脱氢酶的工程菌bl21/prsfduet-1-ldha。
3.根据权利要求2所述的能够高产吲哚-3-乳酸的基因工程菌，其特征在于，所述pcr扩增采用的引物对核苷酸序列为：
4.根据权利要求2所述的能够高产吲哚-3-乳酸的基因工程菌，其特征在于，pcr反应程序为：预变性98℃3min；变性98℃15s；退火65℃30s；延伸72℃1min；终止延伸72℃5min，35个循环。
5.一种生产吲哚-3-乳酸的新方法，其特征在于，将如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌制备成纯酶或静息细胞，以色氨酸为底物，以所述纯酶化学催化色氨酸或以所述静息细胞催化色氨酸合成吲哚-3-乳酸。
6.根据权利要求5所述的新方法，其特征在于，利用异丙基-d-硫代半乳糖苷诱导所述基因工程菌表达d-乳酸脱氢酶，异丙基-d-硫代半乳糖苷的诱导浓度范围为0～1.0mmol/l。
7.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在制备保护卵巢功能的药物中的应用。
8.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在制备抗卵巢早衰药物中的应用。
9.如权利要求1-4任一项所述的基因工程菌在制备促进肿瘤免疫治疗药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为结肠癌，所述的免疫治疗为抗pd-1抗体治疗。
