本发明属于crispr/cas9基因编辑，具体涉及一种靶向敲除人核糖体蛋白l26 (rpl26)基因的sgrna及其应用。
背景技术：
1、rpl26基因编码了核糖体蛋白l26，这是核糖体的组成成分之一。核糖体是细胞内的重要结构，负责蛋白质合成过程中的翻译。l26蛋白在核糖体中的作用包括参与翻译过程中的核糖体组装、稳定和功能调控，它与其他核糖体蛋白一起协同工作，帮助将mrna翻译成蛋白质。因此，rpl26基因的功能对于细胞内蛋白质合成过程至关重要。
2、一些研究表明，在某些癌症中，如肺癌和乳腺癌，rpl26的表达水平可能会升高。此外，在一些炎症性疾病和自身免疫性疾病中，也观察到rpl26的表达水平升高的情况。还有一些疾病如：阿尔兹海默症也有报导称rpl26的表达量是增加的。因此，在rpl26升高的疾病中敲除rpl26可能会治疗的作用。
3、目前敲除rpl的手段有很多种，如： shrna：小发卡或短发卡rna（a small hairpinrna or short hairpin rna, shrna）、 sirna：小或短干扰rna（small/short interferingrna, sirna）等。shrna是可以克隆至表达载体并表达双链sirna的rna分子，包括两个短反向重复序列shrna是可以克隆至表达载体并表达双链sirna的rna分子，包括两个短反向重复序列。这两种方式都是在mrna水平上对基因进行沉默或干扰。这两种只能使基因的mrna表达含量降低并不能在基因组上敲除rpl26本身。敲除rpl26后，生命活动中还有其他核糖体合成的重要组成部分如rpl24等，可以维持正常的生命活动。
4、crispr/cas9是第三代基因编辑技术，源自细菌和古细菌的适应性免疫系统，利用rna介导的cas9核酸内切酶对特定dna序列进行识别、切割，进而实现对基因组的精确编辑。crispr/cas9系统构建简单，可实现单基因多位点或多基因的同时敲除，且在基因组中易于选择高效编辑的位点。
技术实现思路
1、本发明根据sgrna的设计原则，在人的核糖体蛋白l26 (rpl26) cds区(蛋白质编码区)的近5’端采用头对头排列的形式设计了两条sgrna，分别构建了两条单sgrna重组质粒，这两条sgrna的区别为：sgrna1在cds的有功能的结构域区域，sgrna2在cds的非功能区域。经sanger测序鉴定、及t7核酸内切酶1（t7e1）证实，设计在cds的有功能的结构域区域sgrna1经t7 ei酶并未验证出明显的切割条带但sanger测序发现sgrna1作用之后g（胞嘧啶）突变成了t（胸腺嘧啶），设计在cds的非功能区域sgrna2验证出切割了基因组，但sanger测序发现在基因组sgrna后均实现了移码突变。
2、本发明的技术方案如下：登录ncbi(the national center for biotechnologyinformation)网站检索人rpl26基因的cds序列。根据sgrna的设计原则，主要识别cds区域中的ngg位点，在cds区(蛋白质编码区)的近5’端采用头对头排列的形式设计了两条sgrna。分别命名为sgrna1，sgrna2，具体序列如下：
3、sgrna1：5’- caccgacataatcttccttcgaatg-3’
4、sgrna2：5’- caccgaccgaagcaagaatcgcaaa-3’
5、将合成后的两条sgrna分别于px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9载体连接,构建了2个靶向 rpl26基因的单sgrna重组质粒。通过sanger测序鉴定，2条sgrna均可实现对 rpl26基因特异性切割，并且sgrna识别位点后均发生了移码突变。
6、本发明还提供了一种crispr/cas9系统，该系统包括上述sgrna和cas9质粒。
7、本发明还提供了一种人核糖体蛋白l26基因敲除的细胞株。通过将构建好的两个质粒通过lip3000转染进入hek 293t细胞，验证两条sgrna的敲除效率，发现sgrna设计在cds的功能区域还是不具有功能的区域，这两条sgrna都可以作用于基因组使其发生移码突变。通过sanger测序及t7核酸内切酶1（t7e1）等多种方法，证实了hek 293t细胞无论是在基因组上还是蛋白水平上有显著性的切割效果和移码突变。
8、本发明所构建的人核糖体蛋白l26基因敲除的细胞株可作为细胞模型在研究人核糖体蛋白l26基因相关疾病中的应用。
9、本发明取得的有益效果如下：本发明中针对人生物 rpl26基因5’端cds区设计的2条sgrna，sgrna2的切割活性相较于sgrna1较高，从而激活细胞的dna修复机制，导致碱基的缺失或插入，最终引发移码突变，实现对rpl26基因的高效敲除，最终将 rpl26基因在人hek293t细胞中成功敲除。
1.一种用于靶向敲除人核糖体蛋白l26基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna为sgrna1或sgrna2，所述sgrna1、sgrna2的核苷酸序列如下：
2.根据权利要求1所述的用于靶向敲除人核糖体蛋白l26基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna1或sgrna2还包含bbsi酶切后同源序列，所述sgrna1、sgrna2的核苷酸序列如下：
3.一种用于靶向敲除人核糖体蛋白l26基因的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包含权利要求1所述sgrna1的核苷酸序列或包含权利要求1所述sgrna2的核苷酸序列。
4.权利要求3所述重组质粒的构建方法，其特征在于，将权利要求2所述的sgrna通过bbsi酶切以及t4 dna连接酶与px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9载体连接，构建靶向rpl26基因的重组质粒。
5.一种crispr/cas9系统，其特征在于，所述crispr/cas9系统包括权利要求1所述的sgrna和cas9质粒。
6.一种人核糖体蛋白l26基因敲除的细胞株，其特征在于，所述细胞株是用权利要求1所述的用于靶向敲除人核糖体蛋白l26基因的sgrna或权利要求3所述的用于靶向敲除人核糖体蛋白l26基因的表达载体敲除了人核糖体蛋白l26基因的细胞株。
7.根据权利要求6所述的人核糖体蛋白l26基因敲除的细胞株，其特征在于，所述细胞株为人胚肾细胞株。
8.如权利要求6或7所述的人核糖体蛋白l26基因敲除的细胞株作为细胞模型在研究人核糖体蛋白l26基因相关疾病中的应用。
