本发明属于荧光探针，涉及一种高特异性肿瘤成像的荧光探针、制备方法及其应用，具体涉及利用肿瘤生长、侵袭、迁移相关肽酶以及维持肝癌细胞在乏氧、和氧化还原失衡的环境中顽固生长的生物标志物之间相辅相成的联系，实现肝肿瘤边界的高精准可视化成像的应用。
背景技术：
1、肝细胞癌作为肝癌的最主要亚型，对它的研究具有重大意义。针对病灶过表达的生物标志物设计的特异性荧光探针具有可视化成像肿瘤边界，辅助临床高质量切除肿瘤的潜力。丙氨酸氨基肽酶(apn/cd13)在肿瘤生长的过程中辅助水解基底膜从而促进血管内皮生长因子(vegf)的释放，导致肿瘤附近的血管密集更容易从生物体摄取营养，为肿瘤的侵袭和转移提供了极其方便的条件视为肿瘤的攻击。除此之外，为保证肿瘤在乏氧、免疫系统以及外来药物刺激下的顽固生长，肿瘤特异性的有氧糖酵解代谢方式将有效降低细胞内具有杀伤能力的活性氧的生成，并过表达醌氧化还原酶(hnqo1)等具有还原性的生物标志物为肿瘤提供了一层强有力的防御。利用肿瘤生长展现的攻击特性以及肿瘤生存发展的防御特性，设计了一系列针对肿瘤多维度特征的小分子荧光探针，这些荧光探针将改善目前大多数荧光探针存在的假阳性信号问题，具有可视化成像肿瘤边界，辅助临床高质量切除肿瘤的能力。
2、近些年来荧光分析技术已经用于生物分子的标记、环境监测、细胞染色和临床诊断等多个领域，其中已经报道的用于肿瘤诊断的大多数荧光探针仅利用肿瘤单方面的标志物，这会导致探针特异性不足，造成假阳性信号。这是被选用设计探针的一些标志物除了在病理环境中充当重要作用，在生理环境中仍扮演重要角色。因此搞清楚肿瘤多方面标志物的联系，设计高特异性，无假阳性信号的荧光探针将为区分肿瘤边界实现高精准度的可视化成像提供最大的帮助。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高特异性肿瘤成像的荧光探针、制备方法及其应用，所述荧光探针具有高精准度可视化肝细胞癌组织和癌旁组织边界性质，本发明利用肿瘤攻击和防御两个过程的生物标志物，旨在设计和应用具有高特异性的荧光探针，用于肝肿瘤边界的可视化近红外荧光成像，为实现临床高精准度手术提供一种新的选择。
2、为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明一种小分子近红外荧光探针，该探针以肽酶为识别底物，用于检测癌细胞生长、侵袭、迁移，该探针的结构式如式ⅰ、式ⅱ所示：
4、
5、本发明一种高特异性肿瘤成像的荧光探针，该荧光探针的结构式如式ⅲ、式ⅳ所示：
6、
7、其中，所述的荧光探针分别命名为ⅲ(anq)，ⅳ(fanq)，它们具有高灵敏度、高特异性、高时空分辨率、快速成像的特点。上述的荧光探针ⅲ、ⅳ以维持肝癌细胞在乏氧、和氧化还原失衡的环境中顽固生长的生物标志物醌氧化还原酶(hnqo1)为识别位点，构建的高特异性肿瘤成像的荧光探针。
8、本发明提供一种小分子近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
9、(1)将碳酸钾、间苯二酚(化合物1)、溶剂加入第一反应器中进行活化，逐滴滴加化合物2，随后将温度升至预定温度，反应后得到近红外半花菁染料(化合物3)；
10、(2)将化合物3、碳酸钾、9h-芴-9-基)甲基(1-((4-(溴甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(化合物7)置入第二反应器中，并加入溶剂，在设定温度下溶解回流，得到化合物8；
11、(3)将化合物8置于第三反应器中并用二氯甲烷溶解，在预定温度下逐滴滴加哌啶，反应后得到荧光探针ⅰ；
12、涉及到的化学反应式为：
13、
14、其中，在上述小分子近红外荧光探针的制备过程中，所述溶剂采用乙腈；
15、所述碳酸钾、间苯二酚和化合物2的摩尔比为(2～5):(2～5):1；
16、所述化合物2和乙腈的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml；
17、所述化合物3、碳酸钾和化合物7的摩尔比为1:(1～3)：(1～3)；
18、所述化合物3和乙腈的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml；
19、化合物8和哌啶的摩尔比为1：(10～20)；
20、化合物8和二氯甲烷的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml。
21、本发明提供一种高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
22、(1)将n-(4-(羟甲基)苯基)-n，2,2-三甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己基-1,4-二烯-1-基)丙酰胺(化合物9)、三光气置于充满惰性气氛的反应容器中，将超干的二氯甲烷和dipea注入反应体系中，在冰浴下反应设定时间；
23、(2)随后将体系抽干，注入权利要求3所得荧光探针ⅰ的二氯甲烷溶液、dipea的二氯甲烷溶液，反应后得到荧光探针ⅲ(anq)；
24、涉及到的化学反应式为：
25、
26、其中，在上述高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备过程中，所述化合物9、三光气和dipea的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)；
27、所述荧光探针ⅰ和dipea的摩尔比为1：(1～2)；
28、所述荧光探针ⅰ和二氯甲烷的摩尔体积比为1：(2～5)mmol/ml。
29、发明人分别通过核磁共振氢谱、质谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述高特异性成像肿瘤边界的荧光探针anq成功合成。
30、作为一个总的发明构思，本发明还提供一种小分子近红外荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
31、(1)将碳酸钾、4-氟间苯二酚(化合物10)、溶剂加入第一反应器中进行活化，逐滴滴加化合物2，随后将温度升至预定温度，反应后得到近红外半花菁染料(化合物11)；
32、(2)将化合物11、碳酸钾、9h-芴-9-基)甲基(1-((4-(溴甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(化合物7)置入第二反应器中，并加入溶剂，在设定温度下溶解回流，得到化合物12；
33、(3)将化合物12置于第三反应器中并用二氯甲烷溶解，在预定温度下逐滴滴加哌啶，反应后得到荧光探针ⅱ；
34、涉及到的化学反应式为：
35、
36、其中，在上述小分子近红外荧光探针的制备过程中，所述溶剂采用乙腈；
37、所述碳酸钾、4-氟间苯二酚和化合物2的摩尔比为(2～5):(2～5):1；
38、所述化合物2和乙腈的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml；
39、所述化合物11、碳酸钾和化合物7的摩尔比为1:(1～3)：(1～3)；
40、所述化合物11和乙腈的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml；
41、化合物12和哌啶的摩尔比为1：(10～20)；
42、化合物12和二氯甲烷的摩尔体积比为1：(5～10)mmol/ml。
43、本发明还提供一种高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
44、(1)将n-(4-(羟甲基)苯基)-n，2,2-三甲基-3-(2,4,5-三甲基-3,6-二氧代环己基-1,4-二烯-1-基)丙酰胺(化合物9)、三光气置于充满惰性气氛的反应容器中，将超干的二氯甲烷和dipea注入反应体系中，在冰浴下反应设定时间；
45、(2)随后将体系抽干，注入荧光探针ⅱ的二氯甲烷溶液、dipea的二氯甲烷溶液，反应后得到荧光探针ⅳ(fanq)；
46、涉及到的化学反应式为：
47、
48、其中，在上述高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备过程中，所述化合物9、三光气和dipea的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)；
49、所述荧光探针ⅱ和dipea的摩尔比为1：(1～2)；
50、所述荧光探针ⅱ和二氯甲烷的摩尔体积比为1：(2～5)mmol/ml。
51、发明人分别通过核磁共振氢谱、质谱、紫外光谱等手段进行表征，表明所述高特异性成像肿瘤边界的荧光探针fanq成功合成。
52、本发明提供了所述小分子近红外荧光探针在参比探针方面的应用。
53、本发明提供了所述高特异性肿瘤成像的荧光探针在检测肿瘤特异性标志物的应用。
54、本发明提供所述高特异性肿瘤成像的荧光探针，基于高效肿瘤区分策略的一系列探针，分别在体外和细胞内对其进行比较筛选得到的。
55、所述高特异性肿瘤成像的荧光探针在检测肿瘤特异性标志物的应用，采用上述探针对肿瘤特异性底物进行测试。
56、与现有的技术相比，本发明的有益效果：
57、相较于目前已经存在的特异性荧光探针，本发明具有高特异性肿瘤成像优势的荧光探针ⅱ和ⅳ将肿瘤生长的攻击系统和肿瘤的防御系统结合，不需要在分子内引入大体积的靶向基团，也不需要通过大量的筛选得到特异性的位点，具有更好的性价比。
58、相较于未加以改进的荧光探针ⅰ和ⅲ而言，高特异性肿瘤成像的荧光探针能够在细胞水平有效实现正常细胞和肿瘤细胞的区分。
59、具有充分活力且肝肾功能健康的小鼠不能激活高特异性肿瘤成像的荧光探针ⅱ和ⅳ，这将为实现肝肿瘤边界的可视化提供可靠的基础；
60、人体组织具有更加复杂的成分和结构，基于肿瘤单一方面设计的荧光探针将难以展现出体外测试出的高选择性，高特异性肿瘤成像的荧光探针ⅱ和ⅳ能在复杂的生物体中仍表现出优异的选择性，具有可视化肿瘤边界的优异特性。
1.一种小分子近红外荧光探针，其特征在于，该探针的结构式如式ⅰ、式ⅱ所示：
2.一种高特异性肿瘤成像的荧光探针，其特征在于，该荧光探针的结构式如式ⅲ、式ⅳ所示：
3.一种小分子近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述一种小分子近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂采用乙腈；
5.一种高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述一种高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述化合物9、三光气和dipea的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)；
7.一种小分子近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述一种小分子近红外荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂采用乙腈；
9.一种高特异性肿瘤成像的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
10.根据权利要求2所述高特异性肿瘤成像的荧光探针在检测肿瘤特异性标志物的应用。
