本发明涉及天然化合物应用领域，具体涉及天然化合物甘草酸与人工合成化合物ra190单独和联合用药作为抑制马立克氏病病毒复制以及抗马立克氏病发生药物的应用。
背景技术：
1、鸡感染致病型血清i型马立克氏病病毒(mdv)要引起马立克氏病(md)，md是一种高致死性、内脏多发性肿瘤的病毒性传染病。鸡是mdv最重要的自然宿主，mdv属于细胞结合性的疱疹病毒科，其分子结构和基因组成与α疱疹病毒相似。
2、目前防御md的主要手段是接种md疫苗，有研究表明，接种md疫苗能保护鸡群不发生md恶性肿瘤，但md疫苗免疫的鸡仍可感染mdv，md疫苗并不能阻止mdv在鸡体内的复制、成熟和释放。因此，经md疫苗免疫的鸡也就成为mdv新的传染源，加上疫苗的免疫压力，进而促进了mdv毒力不断增强，出现了毒力更强的mdv毒株。因此，mdv仍然是养禽业的重要威胁。但阻止mdv在鸡细胞内的复制是扼制mdv增殖、扩散和毒力增强的有效办法，也是控制md暴发，增强疫苗的防御效果的关键。
3、ra190的cas号为1617495-03-0，其分子式为c28h23cl5n2o2，相对分子质量为596.76。研究发现ra190与19s调节颗粒中的泛素受体rpn13的半胱氨酸88共价结合，并抑制蛋白酶体功能，引发多泛素蛋白的快速积累。多发性骨髓瘤(mm)系，即使是对硼替佐米具有耐药性的骨髓瘤，也通过内质网应激相关的细胞凋亡对ra190敏感。ra190稳定人乳头瘤病毒e6癌蛋白的靶点，并优先杀死hpv转化的细胞。ra190还在软骨发育与原发性肝癌治疗中发挥作用，但至今未见任何关于ra190抗马立克氏病或任何抑制mdv病毒复制及活性的报道。
4、甘草酸的中文其他名称有甘草甜、甘草酸、强力宁、甘草酸苷、甘草皂甙、甘草甜素、甘草皂苷、甘草蛋白、甜味剂甘草、α-甘草酸等，英文名称为glycyrrhizic acid，cas号为1405-86-3,分子式为c42h62o16,分子量为822.94。甘草酸是甘草主要成分，具有特殊的甜味，在食品、医药、化妆品及卷烟等行业广泛应用。甘草酸在临床上已被用于治疗慢性肝炎。甘草酸在体外可明显抑制hiv阳性病人血单核细胞中的hiv复制。甘草酸还可以减少感染了致死剂量流感病毒的小鼠的发病率和死亡率。甘草酸对sars-cov冠状病毒ffm-1和ffm-2两毒株的复制具有强烈的抑制作用。甘草酸还具有抗炎、抗变态反应、解毒保肝等临床作用。甘草酸在多种细胞多种生命进程发挥作用，但至今未见任何关于甘草酸抗马立克氏病或任何抑制mdv病毒复制及活性的报道。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种抑制马立克氏病病毒的药物，所述药物包括ra190和/或甘草酸。
2、本发明是提供的药物能够抗鸡md的发生，抑制mdv在鸡细胞内的复制，提高md疫苗防御效果，扼制mdv毒力的增强。本发明提供了一种ra190、甘草酸单独用药以及联合用药作为抑制mdv复制和抗鸡马立克氏病药物的新用途，基于mdv编码的mdv049蛋白酶和ul23胸苷激酶活性抑制系统，以及细胞接种病毒和马立克氏病动物模型，筛选出ra190、甘草酸单独用药以及联合用药在安全用药量下能有效地抑制mdv的复制、攻毒实验动物模型肿瘤的产生。
3、优选的是，所述药物用于抑制马立克氏病病毒(mdv)复制，包括ra190、甘草酸单独用药以及联合用药。本发明所述的ra190、甘草酸单独用药以及联合用药，具有抗mdv和md的效果。
4、本发明所使用的药物如无特殊说明均为商业化试剂或利用现有技术方法人工合成的试剂混合而成，ra190、甘草酸制备或提取方法为现有技术内容，不是本发明保护的主题。
5、上述任一项优选的是，所述药物为ra190。
6、上述任一项优选的是，所述药物为甘草酸。
7、上述任一项优选的是，所述药物为ra190和甘草酸，所述ra190和甘草酸联合使用大大提高了所述药物抑制马立克氏病病毒的效果。
8、ra190抑制mdv编码的mdv049蛋白酶活性，甘草酸抑制mdv编码的ul23胸苷激酶活性，mdv049蛋白和ul23的功能还未见详细的阐明。本发明对5000余个化合物进行高通量筛选，幸运的发现，所述ra190具有抑制mdv049蛋白酶活性的作用，甘草酸具有抑制ul23胸苷激酶活性。经过本发明的研究，所述ra190通过抑制mdv049蛋白酶或甘草酸通过抑制ul23胸苷激酶均实现了细胞水平抑制mdv复制，而对鸡细胞本身的信号通路和蛋白没有产生显著的抑制作用。
9、ra190作为蛋白酶抑制剂，甘草酸作为胸苷激酶抑制剂，可影响细胞内多种信号通路和蛋白的作用。经过本发明的研究表明，ra190特异性的抑制mdv049蛋白酶活性，甘草酸特异的抑制mdv的ul23胸苷激酶活性。
10、所述ra190和/或甘草酸抑制细胞内mdv的复制。通过向感染mdv的鸡细胞的培养体系中添加所述ra190、甘草酸单独用药和联合用药，mdv复制受到显著的抑制。优选的，所述ra190、甘草酸是在感染了mdv的cef细胞(鸡胚成纤维细胞)或者df-1细胞(鸡胚成纤维细胞系)水平上抑制病毒的复制。
11、上述任一项优选的是，单独用药时，所述ra190在细胞水平作用浓度为0.01～100μm。优选的，浓度为0.01μm、0.12μm、0.02μm、0.04μm、0.1μm、1μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm及其间范围的ra190均有效抑制感染mdv的细胞内mdv的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。优选的，所述ra190浓度大于0.01μm，ra190的浓度大于0.01μm时可显著减少病毒的复制。更为优选的，ra190的浓度大于1.2μm，优选的，当浓度达到1.2μm时，基本上可以完全抑制病毒在细胞内的复制和对细胞的感染，并且在此浓度范围药物对细胞没有造成显著伤害。
12、上述任一项优选的是，单独用药时，所述甘草酸在细胞水平作用浓度为5～300μm。优选的，浓度为5μm、10μm、20μm、50μm、80μm、150μm、200μm、250μm、300μm的甘草酸均有效抑制感染mdv的细胞内mdv的复制，同时对细胞本身没有毒副作用。优选的是，5μm的甘草酸在cef细胞水平抑制mdv的复制；优选的，甘草酸的浓度大于5μm，当甘草酸的浓度大于5μm时可显著减少病毒的复制。更为优选的，甘草酸浓度大于20μm；优选的，当浓度达到20μm时，基本上可以完全抑制病毒在细胞内的复制和对细胞的感染，并且在此浓度范围药物对细胞没有造成显著伤害。
13、上述任一项优选的是，所述ra190在细胞水平作用浓度为0.01～100μm，甘草酸在细胞水平作用浓度为5～300μm，以及在此浓度为范围内的ra190与甘草酸联合用药。进一步优选的，所述药物为ra190和甘草酸在细胞水平联合用药时，在0.01～100μm ra190和5～300μm甘草酸浓度范围内，ra190：甘草酸摩尔浓度比在1：5-1：80的条件下均能发挥协同抑制mdv复制作用，且在1：20的联合用药条件下抑制效果最佳。优选的，ra190：甘草酸摩尔浓度比1：5、1：10、1：20、1：40、1：80。
14、上述任一项优选的是，所述细胞水平优选的细胞为cef细胞或df-1细胞。优选的，0.01μm的ra190抑制cef细胞的mdv复制。
15、上述任一项优选的是，所述药物用于预防或抗马立克氏病药物。所述ra190、甘草酸单独用药和联合用药。
16、上述任一项优选的是，所述药物在动物体内使用剂量为ra190作用剂量为0.01～510μg/(kg·d)。优选的是，所述ra190动物体内使用剂量不低于0.01μg/(kg·d)。ra190的用量在大于0.01μg/(kg·d)时，显著抑制感染mdv的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制mdv在鸡t细胞内的复制，也即ra190、甘草酸可抑制鸡马立克氏病的发生。
17、上述任一项优选的是，所述药物在动物体内使用剂量为甘草酸作用剂量为3～210mg/(kg·d)。优选的是，甘草酸动物体内使用剂量不低于3mg/(kg·d)。甘草酸的用量在大于3mg/(kg·d)时，显著抑制感染mdv的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制mdv在鸡t细胞内的复制，也即ra190、甘草酸可抑制鸡马立克氏病的发生。
18、上述任一项优选的是，所述药物在动物体内使用剂量为ra190作用剂量为0.01～510μg/(kg·d)，甘草酸作用剂量为3～210mg/(kg·d)，以及在此剂量范围内的ra190与甘草酸联合用药。ra190的用量在大于0.01μg/(kg·d)时，甘草酸的用量在大于3mg/(kg·d)时，单独或联合用药均可显著抑制感染mdv的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制mdv在鸡t细胞内的复制，也即ra190、甘草酸可抑制鸡马立克氏病的发生。
19、上述任一项优选的是，所述动物体内使用剂量为在鸡体内的使用剂量。所述ra190作为mdv049蛋白酶抑制剂,甘草酸作为ul23胸苷激酶抑制剂。本发明首次发现所述ra190在马立克氏病动物模型体内抑制mdv049蛋白酶活性，而对鸡体内自身的蛋白酶没有抑制作用；同时发现，甘草酸在马立克氏病动物模型体内抑制ul23胸苷激酶的活性，而对鸡体内自身的胸苷激酶没有抑制作用，即ra190和甘草酸对鸡没有产生毒副作用。所述剂量可抑制mdv049蛋白酶和ul23胸苷激酶活性，可显著抑制感染mdv的鸡的内出血和肿瘤等症状的出现，并且抑制mdv在鸡t细胞内的复制，即抑制鸡马立克氏病的发生。
20、上述任一项优选的是，所述药物的给药方式包括口服、腹腔注射或肌肉注射的至少一种。
21、上述任一项优选的是，单独用药剂量：口服时，ra190使用剂量为10～510μg/(kg·d)。
22、上述任一项优选的是，单独用药剂量：口服时，甘草酸使用剂量为18～210mg/(kg·d)。
23、上述任一项优选的是，口服时，ra190与甘草酸联合用药剂量为：ra190使用剂量为10～510μg/(kg·d)，甘草酸使用剂量为18～210mg/(kg·d)。
24、上述任一项优选的是，单独用药剂量：腹腔注射时，ra190使用剂量为0.01～120μg/(kg·d)。
25、上述任一项优选的是，单独用药剂量：腹腔注射时，甘草酸使用剂量为3～120mg/(kg·d)。
26、上述任一项优选的是，腹腔注射时，ra190与甘草酸联合用药剂量为：ra190使用剂量为0.01～120μg/(kg·d)，甘草酸使用剂量为3～120mg/(kg·d)。
27、上述任一项优选的是，单独用药剂量：肌肉注射时，ra190使用剂量为2～240μg/(kg·d)。
28、上述任一项优选的是，单独用药剂量：肌肉注射时，甘草酸使用剂量为11～180mg/(kg·d)。
29、上述任一项优选的是，肌肉注射时，ra190与甘草酸联合用药剂量为：ra190使用剂量为2～240μg/(kg·d)；甘草酸使用剂量为11～180mg/(kg·d)。
30、上述任一项优选的是，分别在上述单独用药的口服、腹腔注射、肌肉注射的剂量范围内，ra190与甘草酸联合用药；进一步优选的，在上述用药剂量范围内，ra190：甘草酸用药量比在1：200-1：2000的条件下均能发挥协同抑制动物体内mdv的复制和抗md作用，且在1：1000的联合用药条件下抑制效果最佳，优选的联合用药ra190：甘草酸用药量比为1：200、1：500、或1：2000。
31、上述任一项优选的是，所述ra190，当口服时ra190剂量为10～510μg/(kg·d)，优选的，ra190效果最佳的口服剂量为200μg/(kg·d)，其他优选的ra190口服剂量为10、15、20、25、40、60、80、100、150、170、200、220、250、300、350、400、450、510μg/(kg·d)，及其间范围；当腹腔注射时ra190剂量为0.01～120μg/(kg·d)，优选的，ra190效果最佳的腹腔注射剂量为25μg/(kg·d)，其他优选的ra190腹腔注射剂量为0.01、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、25、50、100、120μg/(kg·d)及其间范围；当肌肉注射时ra190剂量为2～240μg/(kg·d)，优选的，ra190效果最佳的肌肉注射剂量为40μg/(kg·d)，其他优选的ra190肌肉注射剂量为2、7、12、19、26、38、42、72、97、113、144、184、209、220、240μg/(kg·d)及其间范围。
32、上述任一项优选的是，所述甘草酸，当口服时甘草酸剂量为18～210mg/(kg·d)，优选的，甘草酸效果最佳的口服剂量为75mg/(kg·d)，其他优选的甘草酸口服剂量为18、30、40、60、80、100、150、170、210mg/(kg·d)及其间范围；当腹腔注射时甘草酸剂量为3～120mg/(kg·d)，优选的，甘草酸效果最佳的腹腔注射剂量为30mg/(kg·d)，其他优选的甘草酸腹腔注射剂量为3、5、10、20、40、60、80、100、120mg/(kg·d)及其间范围；当肌肉注射时甘草酸剂量为11～180mg/(kg·d)，优选的，甘草酸效果最佳的肌肉注射剂量为60mg/(kg·d)，其他优选的甘草酸肌肉注射剂量为11、22、36、50、60、80、100、120、140、160、180mg/(kg·d)及其间范围。
33、上述任一项优选的是，所述ra190、甘草酸在所述用药剂量范围内的联合用药。所述用药剂量范围包括口服、腹腔注射或肌肉注射至少一种的用药范围。
34、上述任一项优选的是，所述mdv为血清i型mdv。
35、上述任一项优选的是，所述ra190、甘草酸在本发明所述的用药剂量范围内的单独以及联合用药抑制感染mdv鸡md肿瘤生成。
36、本发明还提供了ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在抑制mdv复制药物制备中的应用。
37、本发明还提供了ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在预防或治疗马立克氏病药物制备中的应用。
38、本发明还提供了ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在抑制马立克氏病患病鸡体内肿瘤形成的药物制备中的应用。
39、本发明还提供了ra190作为mdv049蛋白酶抑制剂的应用。优选的，所述mdv049蛋白酶为mdv编码的mdv049蛋白酶。
40、本发明还提供了ra190在制备mdv049蛋白酶抑制剂中的应用。优选的，所述mdv049蛋白酶为mdv编码的mdv049蛋白酶。
41、本发明还提供了甘草酸作为ul23胸苷激酶抑制剂的应用。优选的，所述ul23胸苷激酶为mdv编码的ul23胸苷激酶。
42、本发明还提供了甘草酸在制备ul23胸苷激酶抑制剂中的应用。优选的，所述ul23胸苷激酶为mdv编码的ul23胸苷激酶。
43、本发明的有益处效果是：本发明首次筛选出包括ra190、甘草酸的单独以及联合用药，不仅能够在酶水平上抑制mdv049蛋白酶和ul23胸苷激酶活性，在细胞水平上抑制mdv的复制，还可在动物水平上抑制md肿瘤生长和内脏出血，且具有效果极强。优选的，本发明中ra190作为mdv049蛋白酶抑制剂的使用剂量、甘草酸作为ul23胸苷激酶抑制剂的使用剂量以及联合用药进使用的剂量远低于ra190、甘草酸在常规使用中的有效剂量，具有剂量小的优点，可作为抗md药物广泛用于养禽业防御md的生产实践中，具有良好经济价值及研究意义。
44、本发明中ra190作为mdv049蛋白酶的抑制剂，甘草酸作为ul23胸苷激酶的抑制剂在马立克氏病的治疗中主要是抗病毒，也就是其对于马立克氏病的治疗时间为病毒感染而未发生肿瘤的阶段，通过mdv049蛋白酶和ul23胸苷激酶的酶活抑制病毒复制，抑制肿瘤细胞的产生，从而起到治疗作用。
45、目前，mdv的毒力不断增强，接种了疫苗的鸡群仍然有可能暴发马立克氏病。在此现状下，本发明找到了一个控制马立克氏病的新途径，并能增强md疫苗的效果，而且应用前景广泛。
1.一种抑制马立克氏病病毒的药物，其特征在于，所述药物包括ra190和/或甘草酸。
2.如权利要求1所述的药物，其特征在于，单独用药时，所述ra190在细胞水平作用浓度为0.01～100μm，或所述甘草酸在细胞水平作用浓度为5～300μm；所述药物为ra190和甘草酸在细胞水平联合用药时，在0.01～100μm ra190和5～300μm甘草酸浓度范围内，ra190：甘草酸摩尔浓度比为1：5-1：80。
3.如权利要求1所述的药物，其特征在于，所述药物在动物体内使用剂量为ra190作用剂量为0.01～510μg/(kg·d)，甘草酸作用剂量为3～210mg/(kg·d)。
4.如权利要求1或3所述的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括口服、腹腔注射或肌肉注射的至少一种。
5.如权利要求4所述的药物，其特征在于，单独用药剂量：口服时，ra190使用剂量为10～510μg/(kg·d)，甘草酸使用剂量为18～210mg/(kg·d)；腹腔注射时，ra190使用剂量为0.01～120μg/(kg·d)，甘草酸使用剂量为3～120mg/(kg·d)；肌肉注射时ra190使用剂量为2～240μg/(kg·d)，甘草酸使用剂量为11～180mg/(kg·d)；在权利要求4所述的单独用药剂量范围内，ra190和甘草酸联合用药，ra190：甘草酸用药量比为1：200-1：2000。
6.ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在抑制mdv复制药物制备中的应用。
7.ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在预防或治疗马立克氏病药物制备中的应用。
8.ra190或甘草酸或ra190与甘草酸联合使用在抑制马立克氏病患病鸡体内肿瘤形成的药物制备中的应用。
9.ra190 ra190作为mdv049蛋白酶抑制剂的应用。
10.甘草酸作为ul23胸苷激酶抑制剂的应用。
