本发明属于蛋白合成，特别涉及一种高亲和力甲胎蛋白抗体的制备方法。
背景技术：
1、甲胎蛋白(α-fetoprotein，afp)是一种糖蛋白，是含有3％左右糖分，分子量大约70000的胎球蛋白。正常情况下，afp主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周afp从血液中消失，因此正常人血清中afp含量很低，不到20ug/l。但是当肝细胞发生癌变时，会恢复产生afp的功能，而且随着病情恶化，afp在血清中的含量急剧增加，因此afp成为诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。
2、以afp为检测指标对原发性肝癌进行早期诊断，相比于传统的影像学方法(超声、ct、核磁共振等方法)成本低廉、简便易实现并且大大降低了误诊率。但是，目前在afp检测的方法中，所使用的单抗多采用体内法如小鼠腹水法进行制备，即将afp抗原注射到小鼠腹腔内，从腹水中得到单抗。虽然该方法技术成熟，生产成本低，但是制备周期长，并且存在鼠源中其他抗体的干扰和鼠类动物感染疾病给产物带来的污染问题。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种高亲和力甲胎蛋白抗体的制备方法，通过改进对小鼠的免疫方法，使免疫时间从传统的两个多月缩短到两周，并且大大减少对抗原的消耗量；通过杂交瘤体外培养，获得大批量高纯度的抗体，具有良好的市场应用前景。
2、本发明提供了一种高亲和力甲胎蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：
3、(1)对选取的实验动物进行两次动物免疫：初次免疫时，取甲胎蛋白afp和免疫佐剂a混匀后，注射于选取的动物腹腔；两周后进行第二次免疫，取afp和免疫佐剂b混匀后，再次注射于选取的动物腹腔；
4、(2)融合前3天作腹腔注射加强免疫，融合当天取上述动物的脾细胞，用于制备高亲和力甲胎蛋白抗体。
5、所述步骤(1)中的实验动物为小鼠。优选地，小鼠选用8～12周龄。更优选地，小鼠选用8～12周龄balb/c小鼠。
6、所述步骤(1)中初次免疫时afp的用量为20ug-100ug，优选地，afp的用量为30ug-80ug，更优选地，afp的用量为30ug-50ug。第二次免疫时afp的用量为20ug-80ug，优选地，afp的用量为30ug-50ug。
7、所述步骤(1)中的免疫佐剂a为福氏完全佐剂；免疫佐剂b为福氏不完全佐剂。
8、所述步骤(1)中初次免疫时afp配成溶液后与免疫佐剂a的体积比为1:1，用与其质量(ug)等体积(ul)的pbs溶解；第二次免疫时免疫佐剂b的体积为30～50ul。
9、所述步骤(2)中的癌细胞为sp2/0骨髓瘤细胞。
10、所述步骤(2)中采用中空纤维系统培养杂交瘤细胞制备高亲和力甲胎蛋白抗体。
11、优选的，所述步骤(2)中将脾细胞与癌细胞融合制备杂交瘤细胞；采用双维倍比梯度稀释法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选阳性克隆株用于制备高亲和力甲胎蛋白抗体。
12、优选的，所述步骤(2)中将脾细胞进行单细胞测序，通过生信分析找到产生afp抗体的序列，将该序列插入噬菌体或细菌的基因组中，利用噬菌体或细菌的繁殖制备afp抗体。
13、优选的，所述步骤(2)中将脾细胞通过倍数稀释得到产生高效价抗体的单个脾细胞，对细胞内基因进行测序，找到产生afp抗体的序列，将该序列插入噬菌体或细菌的基因组中，利用噬菌体或细菌的繁殖制备afp抗体。
14、有益效果
15、本发明通过改进对小鼠的免疫方法，使免疫时间从传统的两个多月缩短到两周，并且大大减少对抗原的消耗量；通过杂交瘤体外培养，获得大批量高纯度的抗体，具有良好的市场应用前景。
1.一种高亲和力甲胎蛋白抗体的制备方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的实验动物为小鼠。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中初次免疫时afp的用量为20ug-100ug；第二次免疫时afp的用量为20ug-80ug。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的免疫佐剂a为福氏完全佐剂；免疫佐剂b为福氏不完全佐剂。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中初次免疫时afp配成溶液后与免疫佐剂a的体积比为1:1；第二次免疫时免疫佐剂b的体积为30～50ul。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的癌细胞为sp2/0骨髓瘤细胞。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用中空纤维系统培养杂交瘤细胞制备高亲和力甲胎蛋白抗体。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将脾细胞与癌细胞融合制备杂交瘤细胞；采用双维倍比梯度稀释法对杂交瘤细胞进行筛选，筛选阳性克隆株用于制备高亲和力甲胎蛋白抗体。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将脾细胞进行单细胞测序，通过生信分析找到产生afp抗体的序列，将该序列插入噬菌体或细菌的基因组中，利用噬菌体或细菌的繁殖制备afp抗体。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中将脾细胞通过倍数稀释得到产生高效价抗体的单个脾细胞，对细胞内基因进行测序，找到产生afp抗体的序列，将该序列插入噬菌体或细菌的基因组中，利用噬菌体或细菌的繁殖制备afp抗体。
