本发明属于核酸检测，具体涉及一种基于rpa-crispr技术检测多种碳青霉烯类耐药基因的检测体系和试剂盒。
背景技术：
1、细菌耐药(bacterial antimicrobial resistance,amr)已经成为全球公共卫生领域的重大挑战，多重耐药(multidrug resistance，mdr)、广泛耐药(extensive drugresistance，xdr)、乃至全耐药(pandrug resistance，pdr)细菌的出现和流行给人类健康带来了巨大威胁(aljeldah mm.antimicrobial resistance and its spread is aglobal threat.antibiotics(basel).2022aug；11(8):1082.)。在2019年全球就有约127万例死亡归因于amr，这其中革兰阴性杆菌占2/3，而作为一线治疗多耐革兰阴性杆菌的药物碳青霉烯类抗生素，其耐药率在2019年已占19.13％(243000/1270000)，故有效的控制其耐药率和耐药菌株的传播率尤为重要。因此，临床亟需开发可靠且快速的碳青霉烯类耐药(主要耐药机制为多种碳青霉烯酶的产生，且酶型多样，其药物的抗菌活性与酶型也密切相关)的检测方法来应对当前挑战。
2、目前，用于检测碳青霉烯类耐药的方法主要有两个类型：表型检测和基因型检测(caliskan-aydogan o,alocilja ec.a review of carbapenem resistance inenterobacterales and its detection techniques.microorganisms.2023jun；11(6):1491.)。表型检测有临床常规药敏试验(纸片法、mic法)，改进的hodge试验，改进的碳青霉烯灭活方法(mcim)和乙二胺四乙酸(edta)改良碳青霉烯灭活试验(ecim)，还有一些针对单个酶的检测试验(如硼酸协同试验)等，这些依赖细菌生长的检测方法目前最大的问题在于需要很长时间(长达18-24h)，影响患者的治疗进程。另外，现在快速检测酶型的方法，有碳青霉烯酶催化水解产物的水解方法carba np试验和免疫层析技术(胶体金法)，但对一些酶型的检测敏感性和特异性都存在问题，如carba np试验对oxa-48(oxacillinasecarbapenemases-48)酶型敏感性低，免疫层析技术也只是针对特定的几种酶型；而同样检测蛋白谱的maldi-tof ms技术由于其设备要求高，操作复杂，缺乏广泛的数据库基础，也难以推广。现阶段商品化的对耐药酶型的基因型检测方法主要是pcr技术(cai z,taoj.multicenter evaluation of the xpert carba-r assay for detection andidentification of carbapenemase genes in sputum specimens.jclinmicrobiol.2020aug；58(9):e00644-20.)，其优点是技术成熟、速度快，缺点是因为耐药基因型突变位点较多，所以引物设计的差异对不同酶型的检测敏感性和特异性都影响很大，而且对人员、设备及环境要求也很高。
3、综上所述，针对多基因型且有多突变位点的碳青霉烯类耐药基因，以上这些方法在检测时长、对不同酶型的检测敏感性和特异性以及检测通量上的问题，都是限制其临床应用的关键问题，亟需在检测方法和技术方面做进一步的突破。
技术实现思路
1、解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供一种基于rpa-crispr技术检测多种碳青霉烯类耐药基因的检测体系和试剂盒，能有效解决现有方法检测时间长、操作复杂和灵敏度差等不足之处。
2、技术方案：第一方面，本发明提供一种基于rpa-crispr技术检测多种碳青霉烯类耐药基因的检测体系，包括用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm、imp、vim、kpc、oxa23like、oxa51like、oxa58like和oxa48like的rpa扩增引物组以及crispr系统中识别耐药基因的crrna序列，其中：
3、ndm基因的扩增引物组为：
4、ndm-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，
5、seq id no.1：gcaacacagcctgactttcgccgccaatgg
6、ndm-r的核苷酸序列如seq id no.2所示，
7、seq id no.2：tgctggccttggggaacgccgcaccaaacg
8、imp基因的扩增引物组为：
9、imp-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，
10、seq id no.3：tattggctagttaaaaataaaattgaagtt
11、imp-r的核苷酸序列如seq id no.4所示，
12、seq id no.4：ggaacaaccagttttgccttaccatatttg
13、vim基因的扩增引物组为：
14、vim-f的核苷酸序列如seq id no.5所示，
15、seq id no.5：ctcattgtccgtgatggtgatgagttgct vim-r的核苷酸序列如seq idno.6所示，
16、seq id no.6：atgaaagtgcgtggagactgcacgcgttac kpc基因的扩增引物组为：
17、kpc-f的核苷酸序列如seq id no.7所示，
18、seq id no.7：cggaaagcttacaaaaactgacactgggctctg kpc-r的核苷酸序列如seqid no.8所示，
19、seq id no.8：ctccgcaggttccggttttgtctccgactg
20、oxa23like基因的扩增引物组为：
21、oxa23like-f的核苷酸序列如seq id no.9所示，
22、seq id no.9：tatggtaatgctctaagccgcgcaaatacag oxa23like-r的核苷酸序列如seq id no.10所示，
23、seq id no.10：ccttttctcgcccttccatttaaatatttc
24、oxa51like基因的扩增引物组为：
25、oxa51like-f的核苷酸序列如seq id no.11所示，
26、seq id no.11：tttatcaagatttagctcgtcgtattggac oxa51like-r的核苷酸序列如seq id no.12所示，
27、seq id no.12：catggattgcacttcatcttggactttt
28、oxa58like基因的扩增引物组为：
29、oxa58like-f的核苷酸序列如seq id no.13所示，
30、seq id no.13：atggcacgcatttagaccgagcaaaaacag oxa58like-r的核苷酸序列如seq id no.14所示，
31、seq id no.14：aactttacttcttgtataggtgtaattgtc
32、oxa48like基因的扩增引物组为：
33、oxa48like-f的核苷酸序列如seq id no.15所示，
34、seq id no.15：gcagcaaggatttaccaataatcttaaacg oxa48like-r的核苷酸序列如seq id no.16所示，
35、seq id no.16：tgtccatcccacttaaagacttggtgttcat识别ndm基因的crrna序列如seq id no.17所示，
36、seq id no.17：
37、uaauuucuacuaaguguagauguggcugccugaucaaggacagc
38、识别imp基因的crrna序列如seq id no.18所示，
39、seq id no.18：
40、uaauuucuacuaaguguagauauaaaacaaccaccgaauaauau
41、识别vim基因的crrna序列如seq id no.19所示，
42、seq id no.19：
43、uaauuucuacuaaguguagaugcaccccacgcuguaucaaucaa
44、识别kpc基因的crrna序列如seq id no.20所示，
45、seq id no.20：
46、uaauuucuacuaaguguagauccuuuagccaaucaacaaacu
47、识别oxa23like基因的crrna序列如seq id no.21所示，
48、seq id no.21：
49、uaauuucuacuaaguguagauaauguagaggcuggcacauauuc识别oxa51like基因的crrna序列如seq id no.22所示，
50、seq id no.22：
51、uaauuucuacuaaguguagaucuuacaagcuagcuaauaaaacg
52、识别oxa58like基因的crrna序列如seq id no.23所示，
53、seq id no.23：
54、uaauuucuacuaaguguagauaauguagaugcaggaauauaagc识别oxa48like基因的crrna序列如seq id no.24所示，
55、seq id no.24：
56、uaauuucuacuaaguguagauaagguagaugcggguaaaaaugc。
57、优选的，所述crispr系统包括crispr/cas12a。
58、第二方面，本发明提供一种用于检测碳青霉烯类耐药基因的试剂盒，包括第一方面所述的扩增引物组和crrna序列。
59、优选的，所述试剂盒还包括荧光探针，其中：
60、有益效果：本发明设计的等温扩增方法，操作简单且扩增时不需要温度的变化，不依赖于大型仪器和场地，简易的恒温装置在30min内就可实现基因的放大，且设计的特异性扩增引物可基本覆盖国内流行基因型，完成了第一次的核酸识别和信号放大来提高检测特异性和敏感性；
61、本发明设计的crispr体系，操作简单且能快速识别目的基因后输出信号，10min完成了第二次的核酸识别和信号放大，且设计的特异性crrna也基本覆盖国内流行基因型，进一步提高检测特异性和敏感性；
62、本发明具有一定的经济效益：快速、易操作、可检测多基因型，可以为临床早期的干预治疗提供数据支撑，推动抗生素的精准化治疗，为临床提高治愈率和减少患者住院周期提供帮助；
63、本发明也有一定的社会效益：为推动临床更快更精准的感染治疗方案的制定提供有力支持，同时减慢细菌耐药率的增长速度，这样又好又快的治疗方案有利于提升患者对医生及医院的信任度，从而增加患者就医的依从性。
1.一种基于rpa-crispr技术检测多种碳青霉烯类耐药基因的检测体系，其特征在于，包括用于检测碳青霉烯类耐药基因ndm、imp、vim、kpc、oxa23like、oxa51like、oxa58like和oxa48like的rpa扩增引物组以及crispr系统中识别耐药基因的crrna序列，其中：
2.根据权利要求1所述的一种基于rpa-crispr技术检测多种碳青霉烯类耐药基因的检测体系，其特征在于：所述crispr系统包括crispr/cas12a。
3.一种用于检测碳青霉烯类耐药基因的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的扩增引物组和crrna序列。
